1、植物组织培养实验李永吉 12101705 12 青年农场主班第一部分：培养基母液的配制通过配制母液过程了解植物外植体立体培养所需各种营养成分及激素种类，掌握培养基母液配制的方法。之所以要配制培养基母液，是因为考虑到在配制培养基时使用更方便、操作更简化、用量更准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，所以我们在配制培养基之前将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别量取各种母液即可。实验所需用具器材有：电子天平（检测灵敏度 0.0001g） 、pH 计、托盘电子秤（检测灵敏度
2、0.01g） 、冰箱、烧杯（1000mL、500mL、250mL、50mL） 、量筒（2000mL、1000mL、100mL、50mL） 、试剂瓶（1000mL、250mL、150mL） 、药匙、玻璃棒实验所需药品试剂有：蒸馏水、1N HCl、1N NaOH、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯）实验内容：1、无机大量元素母液的配制（20 倍）按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大 20 倍，用托盘电子秤称取，并用 200mL 蒸馏水溶解于 250mL 烧杯中，如溶解缓慢，可稍加热。CaCl2 单独用 100mL 纯水溶解。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至 1000mL。倒入试剂瓶中并贴好
3、标签，保存于冰箱冷藏。MS 无机大量元素母液配制2、无机微量元素母液配制按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大 200 倍，用托盘电子秤称取，并用 200mL 蒸馏水溶解于 250mL 烧杯中， 。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至 500mL。倒入试剂瓶贴好标签，保存于冰箱。母液名称化合物名称 配方规定量（g/L）贮备液的倍数配制母液称取量/g母液体积/mL配一升培养基时取母液量/mLNH4NO3 1.65 33KNO3 1.9 38CaCl2 0.332 6.64MgSO4.7H2O 0.37 7.4大量元素KH2PO4 0.17203.41000 50MS 无机微量元素母液配制母液名称
4、化合物名称 配方规定量（g/L）贮备液的倍数配制母液称取量/g母液体积/mL配一升培养基时取母液量/mLKI 0.00083 0.083H3BO3 0.0062 0.62MnSO4.H2O 0.0169 1.69ZnSO4.7H2O 0.0086 0.86Na2MoO4.2H2O 0.0025 0.025CuSO4.5H2O 0.00025 0.0025微量元素 CoCl2.6H2O 0.000252000.0025500 53、铁盐母液配制按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大 200 倍，用托盘电子秤称取，并分别用 20mL 蒸馏水溶解于 50mL 烧杯中，溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定
5、容至 100mL。倒入棕色试剂瓶贴上标签，保存于冰箱。MS 铁盐母液配制母液名称化合物名称 配方规定量（g/L）贮备液的倍数配制母液称取量/g母液体积/mL配一升培养基时取母液量/mLFeSO4.7H2O 0.0278 0.556铁盐 Na2.EDTA.2H2O 0.03732000.746100 54、有机母液配制按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大 200 倍，用托盘电子秤称取，用 300mL 蒸馏水溶解于 500mL 烧杯中，溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至 500mL，倒入试剂瓶贴上标签，保存于冰箱中。MS 有机母液配制母液名称化合物名称 配方规定量（g/L ）贮备液的倍数配制母
6、液称取量/g母液体积/mL配一升培养基时取母液量/mL肌醇 0.1 2 100烟酸 0.0005 0.05盐酸吡哆醇（VB6）0.0005 0.05盐酸硫胺素（VB1）0.0001 0.01有机成分甘氨酸 0.00022000.2500 55、激素母液配制各类激素用量最小，为了方便和准确，也配制成母液。母液浓度依据需要和习惯灵活确定。各类激素均不能直接用蒸馏水溶解，而要用各种不同溶剂先洗涤后再用蒸馏水定容。一般的，NAA、IAA、IBA 等生长素是醇溶性的，均可用少量 95%酒精先溶解后再用蒸馏水定容，而 KT、6BA 、ZT 等细胞分裂素可先用少量 1N NaOH 溶解后再用蒸馏水定容。冰箱
7、保存。激素NAA（0.2mg/mL） 先少量 95%乙醇引溶，后加水定容6-BA(2mg/mL) 先少量浓 HCl 引溶，后加水定容第二部分：培养基的配制和灭菌培养基是影响植物组织培养成功与否的最重要因素之一，除了培养材料本身的因素外，培养基的种类、成分等直接影响培养材料的脱分化、继代增值和再分化。我们通过配制 MS 培养基以及灭菌操作掌握其配制方法，灭菌方法和操作过程以及高压灭菌锅的使用方法。培养基是根据植物生长发育的需要进行设计和配制的，配制号的培养基由于含有丰富的营养物质，有利于微生物的生长繁殖，因此配制好的培养基要立即进行灭菌。采用高压灭菌锅对培养基进行灭菌主要原理是在高温下使微生物的
8、蛋白质变性，从而达到杀灭微生物的目的。此部分实验的用具有：电磁炉、不锈钢汤锅（3L） 、烧杯、钥匙、托盘电子称、培养瓶、记号笔、量桶、移液管、吸球、玻璃棒、PH 计。所需实验药品有：大量元素、微量元素等母液，蔗糖、琼脂粉、0.1mol/L HCl、 0.1mol/L NaOH。实验内容： （1）培养基的配制1、培养配方（烟草诱芽培养基）MS+2.0/mg 6-BA+8g/L 琼脂+30g/L 蔗糖2、配制方法洗涤好各种玻璃器皿后，将所需的各种贮存母液按顺序放好，根据所需配制的培养基的量，按照公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算吸取各农业的体积。吸取量=需要配制培养基的体积 x 需要配制浓度
9、/母液浓度配制 1L 培养基各母液的吸取量母液类型 1L MS 培养基的吸取量（mL）大量元素 5mL微量元素 5mL铁盐 5mL维生素 5mL肌醇 5mLNAA 1mL6-BA 1mL取 500mL 烧杯一只，用各母液专用移液管分别吸取各母液，置于烧杯中备用，用纯水定容至 1000mL。取 1000mL 烧杯一只，将上一步获得溶液倒入，在液面处。将溶液倒入汤锅中，加入蔗糖 30g 和琼脂 8g 煮沸，煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免结底。用 1mol/L NaOH 将培养基的 PH 值调至 5.8-6.0。用碱调节 PH 时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用 pH 计测试培养基的 pH 值。调节好
10、 pH 后将培养基分装至培养瓶中。分装完成后，随即用专用耐高温高压的塑料薄膜盖上，用两根橡皮筋封口。待灭菌。（2）培养基的灭菌把分装好的培养基放入消毒灭菌锅的消毒桶内，将外层锅内加入适量的水。然后盖上锅盖，拧紧后，接通电源加热。当灭菌锅压力表指针移至 0.05MPa 时，打开放气阀门排出锅内冷空气，待压力表指针回复到零位后，关闭阀门继续加热。连续放气两次后，当灭菌锅的压力表指针移至 0.1MPa 时，通过调节放气阀，控制热源，使压力表保持在该压力 15-20min。灭菌所需时间到后，待灭菌锅压力表压力降低至“0”时，打开排气阀，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。第三部分：愈伤组织的诱导通过此部分实
11、验了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求，初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术，了解外植体愈伤组织诱导过程。愈伤组织的诱导原理是以幼嫩的器官组织为外植体，在人工培养基和一定的激素诱导下，产生愈伤组织。所需用具器材有：超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片。所需药品试剂有：70%酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水本实验以烟草叶为实验材料。实验内容：1、接种前准备（1）事先备好烟草愈伤组织诱导培养基：MS+NAA(0.2mg/L)+6-BA （2mg/L ）接种室准备 接种前，打开超净工作台和组织培养室紫外灯照射 15-2
12、0min，杀死空气中的微生物。台内用 70%酒精棉球擦拭干净，台面上放置以下用具：酒精灯、70% 酒精缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌纸、培养基、新鲜烟草叶片材料。2、外植体灭菌（2）灭菌时，将选出的健壮无病、幼嫩的茎叶材料稍处理至能放入平板中，倒入升汞盖盖灭菌大约十分钟，期间稍加摇动以充分灭菌，后倒入无菌水清洗残留升汞。随后用 70%酒精浸 30s，立刻用无菌水清洗 3 次。3、接种（1）接种前用 70%酒精棉球擦手表面消毒。（2）将超净工作台上三角瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台左侧。（3）将所用镊子、刀在酒精灯缸内沾以 70%酒精后，在酒精灯火焰上灼
13、烧片刻，灼烧后放在支架上以防在污染。整个接种过程中每隔一段时间将镊子、刀沾酒精灼烧灭菌。（4）外植体处理：用无菌镊子取出外植体，置于灭菌培养皿上进行切割，切取指甲盖大小叶片。（5）用酒精棉球擦拭培养基瓶身、瓶口，轻轻拿掉包头纸，将纸盖外面朝上置于台面上。用镊子将叶片平摆于培养基表面中部，然后用瓶盖封口，扎好橡皮筋，用玻璃记号笔在瓶身注明姓名日期等信息。（6）将培养基放入培养室培养架上培养。第四部分：愈伤组织生长过程观察接种完成后，定期观察愈伤组织的生长情况，直到全班大多数同学的愈伤组织发育完全长出芽可以转移至生根培养基的时候为止。我的两个培养瓶，在第一次观察时便发现染菌，后续观察中基本只有另外
14、一个。1、接种完成 时间：2014.11.09指甲盖大小的烟草叶片被固定在培养基表面中央的位置，叶片略有翘起。2、第一次观察 时间：2014.11.30左侧培养瓶中叶片绿色较淡长势较差，出现黄褐色斑点，叶片周围的培养基表面出现少量黄色液体，判断培养瓶内出现污染。右侧培养瓶中叶片开始生长愈伤组织，绿色鲜艳，体积增大明显，长势良好，无异常。3、第二次观察 时间：2014.12.10上次判断可能被污染的培养瓶中叶片停止生长，褐色加深。培养基表面大面积覆盖白色不明菌丝，以及二十粒左右黑色绿豆大小霉点。另一个培养瓶愈伤组织在靠近瓶壁的位置，长势良好，有大量不规则泡沫状愈伤组织形成，体积显著增大，绿色鲜艳
15、。4、第三次观察 时间：2014.12.22未被污染的培养瓶中愈伤组织在这段时间生长速度最快，体积已经达到上次观察的 4 倍左右，愈伤组织向培养基中生长胀破了固体培养基直至瓶底。并且出现了少量很小的芽和白色的根。被污染的培养基霉菌增多，颜色变深。5、第四次观察 时间：2014.12.29（转生根培养基前）愈伤组织发育很好，外缘波浪状，有很多嫩芽，比较大的芽有 3-4 厘米。部分愈伤组织成白色，有生根的趋势。培养瓶内壁有大量水珠。第五部分：组织培养根诱导诱导生根的原理是通过调节培养生长素和细胞分裂素浓度和比例，组织培养出的小苗会生长。1、生根培养基制作（MS+0.2mg/L NAA）生根培养基配
16、制步骤方法大致与诱芽培养基配制方法相同，依然用之前配制的贮存于冰箱中的母液。需要注意的是诱根培养基比诱芽培养基少 6-BA（2mg/L） 。2、转移烟草芽在无菌操作台，注意事项和步骤与接种类似。用镊子取出培养瓶中的愈伤组织，找到生长健壮，绿色较深的芽，切下芽（保留一部分愈伤组织）用镊子将其按入生根培养基中部。完成后，用记号笔在瓶身做好标记。3、生根情况观察转移完成 时间：2014.12.29接种的两个烟草芽，都比较小。一个颜色深，长相好，另一个颜色浅，泛黄。第一次观察 时间：2015.01.08接种的颜色深的芽存活，开始长叶和生根。颜色浅的芽颜色依然很黄，基本没有生长。第二次观察 时间：2015.01.15叶片绿色较深的幼苗略微有一点生长，开始长出少量的根。叶片颜色较黄的幼苗也有一点生长，但是颜色没有变化，仍然较黄，同时在培养基表面出现橙红色物质，可能被污染。与其他同学的幼苗生长和生根情况比较，发现其他的培养瓶中幼苗叶片数量较多，茎秆粗壮，颜色深绿，根大量长出。判断我的幼苗生长状况差的原因可能有以下几点：1、选取的芽比较小，先天不足2、基部留的愈伤组织过少3、愈伤组织向培养基插入的太浅，不能充分吸收养分
