1、基金项目 “重大新药创制”科技重大专项：“适宜于中药复方多组分特色的缓控释给药系统的关键技术研究”课题编号：2009ZX09502-008；“中药生产技术及过程控制技术标准平台 ”课题编号：2009ZX09308-003；教育部博士点基金（课题编号 20090013110007） 。通讯作者 *杜守颖，女，教授，博士生导师。研究方向：中药新剂型与制剂关键新技术。 Tel：（010）84738615，E-mail ： 。作者简介 马 勇，在读研究生，主要从事中药新剂型与新技术， Email :mayong_。醒脑静固体制剂中挥发性成分环糊精包合物制备工艺研究马 勇，杜守颖*，黎 迎，陆 洋，宋
2、逍，陈晓兰（北京中医药大学 中药学院，北京 100102）摘要 目的：优化醒脑静固体制剂中挥发性成分艾片、人工麝香的 -环糊精包合工艺。方法：以球磨法包合艾片和人工麝香；以艾片中龙脑和人工麝香中麝香酮包合率作为评价指标，采用 Box-Behnken 响应面设计考察环糊精用量、加水量及包合时间对包合物制备工艺的影响，运用 Design-Expert 软件对工艺参数拟合优化并进行验证。结果：最佳工艺为：龙脑和麝香酮质量-环糊精质量比为1:8，环糊精-水质量比为 1:4，包合时间为 53 min，龙脑和麝香酮理论包合率分别为 98.82%和 83.33%；经验证，龙脑及麝香酮包合率分别为 97.41
3、%和82.59%。结论：采用球磨法包合，结合 Box-Behnken 响应面法优选的艾片、人工麝香-环糊精包合物制备工艺稳定可行，包合率高，适用于生产。关键词 醒脑静；艾片；人工麝香；-环糊精包合物；Box-Behnken 响应面设计Study on Preparation process of volatile components - -cyclodextrin Inclusion compound from the Oral Solid Preparation of XingnaojingMA Yong，DU Shou-ying*，LI Ying， LU Yang， SONG Xiao，
4、CHEN Xiao-lan(School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102 ，china)Abstract Objective：To optimize the Preparation process of the Aipian- artficial moschus- cyclodextrin inclusion compound from the Oral Solid Preparation of Xingnaojing. Method: To include Aipi
5、an and artficial moschus by Ball grinding method;the entrapment efficiency of borneol in Aipian and muscone in artficial moschus were investigated as the index, to investigate the amount of -cyclodextrin, inclusion time, the amount of water which effect the Preparation process of -cyclodextrin inclu
6、sion compound using Box-Behnken response surface method,Design-Expert software was applied to imitate,optimize and verify the Process parameter. Result: The optimal process: the weight rate of borneol, muscon and -cyclodextrin was 1: 8, the weight rate of -cyclodextrin and water was 1: 4, inclusion
7、time was 53 min, the theoretical entrapment efficiency of Borneol and muscone were 98.82% and 83.33% respectively; by verification, the entrapment efficiency of Borneol and muscone were 97.41% and 82.59% respectively. Conclusion: The optimized preparation process of Aipian- artficial moschus- cyclod
8、extrin inclusion compound by Ball grinding method and Box-Behnken response surface method is stable and feasible, the entrapment efficiency is high ,it can be used for production.Key words Xingnaojing ;Aipian; artficial moschus; - cyclodextrin inclusion compound; Box-Behnken response surface method醒
9、脑静固体制剂由醒脑静注射液进行剂型改造而得，由人工麝香、艾片、栀子、郁金组成。方中药物多含挥发性成分，在生产和贮存时易挥发损失，影响制剂质量和临床疗效。- 环糊精包合具有增加药物的稳定性、防止挥发、降低药物刺激性等特点 1。本实验将醒脑静方中艾片、人工麝香制成 -环糊精包合物，以增加方中挥发性成分的稳定性，对提高其临床疗效具有重要的意义。本实验采用球磨法进行包合，操作简便，适合工业生产；以 Box-Behnken 响应面设计法优选包合物的制备工艺，并以非线性数学模型拟合，复相关系数高，预测实验结果接近实际实验结果，且使用方便，被广泛地应用于药学研究中 2-4。1 仪器与试药1.1 仪器安捷伦
10、7890A 型气相色谱仪，安捷伦 7683B 进样器，安捷伦工作站； DB-WAX 型气相毛细管色谱柱（30 m0.53 m，1.00 m，美国惠普） ；分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司） ，变频行星式球磨机（南京大冉科技有限公司） 。1.1 试药龙脑对照品（中国药品生物制品检定所，110881-200706） ，麝香酮对照品（中国药品生物制品检定所，110719-200613） ，艾片（贵州金色制药有限责任公司，龙脑含量 88.16%） ，人工麝香（北京联馨药业有限公司，麝香酮含量6.02%） ，-环糊精（北京奥博星生物技术责任有限公司） ，十八烷（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）
11、，无水乙醇（分析纯，北京化工厂） ，其它试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 方法学考察DB-WAX 型气相毛细管色谱柱；检测器：氢火焰离子检测器；氢气流量：30 mLmin-1；进样口及检测器温度：250 ；氮气流速：6 mLmin-1；采用程序升温：起始温度为 140 ，保持 9 min，以 30 min-1 上升至 200 ，保持 6 min；分流比为 20:1；进样量 1 L。色谱图见图 1。图 1 气相色谱图 A：空白内标色谱图；B：对照品色谱图；C：供试品色谱图1-龙脑 2-十八烷 3-麝香酮Figure 1 The GC Chromatogras A:Blank B: Stand
12、ard C:Sample1- borneol 2- octadecane 3- muscon2.1.1 对照品、供试品溶液制备内标液的配制 精密称定十八烷于量瓶中，加无水乙醇配制成每 mL 含十八烷 149.545 g 的内标液，备用。对照品溶液的制备 精密称取龙脑和麝香酮对照品，加上述无水乙醇内标液配制成每 mL 含龙脑和麝香酮 690.40 g、322.80 g 的对照品贮备液。供试品溶液制备 精密称取包合物约30 mg，置于 10 mL量瓶中，加十八烷无水乙醇内标液定容至刻度，超声25 min，补足体积，滤过，取续滤液进行测定。2.1.2 线性关系考察精密移取一定量对照品储备液，用内标液
13、配制成34.52、69.04、138.08、276.16、414.24、690.40 gmL-1 的龙脑对照品溶液和16.14、32.28、64.56、129.12、193.68、322.80 gmL-1 的麝香酮混合对照品溶液。以龙脑的浓度为横坐标，龙脑与内标峰面积的比值为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y =0.0058X-0.0088，r =0.9999，龙脑在 34.52690.40 gmL-1范围内线性关系良好；以麝香酮的浓度为横坐标，麝香酮与内标峰面积的比值为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=0.0059X -0.0045，r =0.9999，麝香酮在 16.14 322.8
14、0 gmL-1 范围内线性关系良好。2.1.3 精密度实验精密称取龙脑和麝香酮对照品，加无水乙醇十八烷内标液配制成低、中、高三个浓度混合对照品，于同 1 天内测定 5 次并于第 2、3、4、5 天内分别测定，计算日内和日间精密度。龙脑日内精密度 RSD 分别为 0.09%，0.44%，和 2.78%；日间精密度 RSD 分别为 0.40%，1.15%，2.24%。麝香酮日内精密度 RSD 分别为 0.78%，0.24%，和 0.44%；日间精密度 RSD 分别为1.24%， 0.36%，1.35%。符合实验要求。2.1.4 稳定性试验取供试品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样测
15、定，各时间点龙脑、麝香酮与十八烷峰面积比值 RSD 分别为 1.37%和 0.52%，符合实验要求。2.1.5 回收率实验精密称取包合物，加入龙脑和麝香酮混合对照品，按“供试品溶液制备” 处理，平行操作 6 份，计算回收率，龙脑平均回收率为 96.47%，RSD 为 1.07%；麝香酮平均回收率为 103.73%，RSD 为 1.34%。2.2 艾片-人工麝香- 环糊精包合物制备按处方配比称取艾片0.5 g，置于球磨机罐中，用1 mL无水乙醇溶解，加入人工麝香3.75 g，再加入相应的蒸馏水和-环糊精，转速为300 rmin -1，球磨一定时间后，置冰箱冷藏24 h，抽滤，用乙酸乙酯洗涤沉淀物
16、。将沉淀物置于50 C的减压干燥箱中干燥6 h，精密称定其质量后，粉碎，过80目筛，置干燥器中备用。包合率 10%包 合 物 中 龙 脑 （ 麝 香 酮 ） 含 量 包 合 物 重 量加 入 龙 脑 （ 麝 香 酮 ） 重 量2.3 Box-Behnken 响应面法优化包合物制备工艺根据预实验考察结果，选择加入环糊精量、蒸馏水体积、包合时间为因素，以龙脑、麝香酮包合率为评价指标对包合工艺进行优化。因素水平、Box-Behnken试验因素设计及结果见表1和表2。表1 因素水平表Table1 Level of factor因素水平 环糊精用量/g 蒸馏水体积/mL 球磨时间 /min-1 3 15
17、 300 4 20 601 5 25 90表2 Box-Behnken设计及结果Table 2 Experimenttal runs and values of responses for Box-behnken design std Run -CD/g 水/mL 包合时间/min龙脑包合率 %麝香酮包合率%8 1 1 -1 0 96.30 74.0611 2 1 0 -1 95.89 80.619 3 0 1 1 88.00 65.6810 4 0 0 0 96.00 74.746 5 0 0 0 95.69 74.751 6 0 -1 1 87.19 61.164 7 -1 1 0 80.
18、29 52.9313 8 0 0 0 94.39 74.8516 9 0 0 0 96.06 75.843 10 0 0 0 95.47 75.165 11 -1 0 1 81.76 61.9614 12 0 1 -1 88.74 62.0212 13 1 0 1 95.77 76.3217 14 -1 0 -1 78.56 58.7515 15 -1 -1 0 82.35 57.002 16 0 -1 -1 91.80 67.537 17 1 1 0 93.993 78.72表 3 龙脑包合率二项式回归模型系数显著性检验表Table 3 Significance analysis for r
19、egression equation of entrapment efficiency of borneol方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值Model 623.82 9 69.31 38.51 0.0001A-环糊精量 435.27 1 435.27 241.81 0.0001B-蒸馏水体积 5.48 1 5.48 3.04 0.1246C-球磨时间 0.66 1 0.66 0.36 0.5652AB 0.016 1 0.016 8.680E-003 0.9284AC 2.76 1 2.76 1.53 0.2559BC 3.74 1 3.74 2.08 0.1924A2 69.2
20、9 1 69.29 38.49 0.0004B2 40.96 1 40.96 22.76 0.0020C2 47.44 1 47.44 26.35 0.0013Residual 12.60 7 1.80Lack of Fit 11.12 3 3.71 0.04 0.0247Pure Error 1.48 4 0.37Cor Total 636.42 16表 3 为龙脑包合率实验方差分析结果，由结果可知：环糊精用量有显著性差异，而蒸馏水体积和球磨时间无显著性差异。经 F 值检验显示总模型方程显著 ( P 0.0001) ，r=0.9901，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准
21、确的预测实际情况。其校正定系数 (R2 adj) 为 0.9547，表明此模型能解释 95.47%效应值变化，试验误差较小。拟合回归方程为：Y1=95.41+7.38A-0.83B-0.29C-0.063AB-0.83AC+0.97BC-4.06A2-3.12B2-3.36C2。多元线性回归的相关系数 r=0.8328，其校正决定系数 (R2 adj) 为 0.6229，不如二项式回归拟合，线性方程为：Y 1 =90.45+7.38A-0.83B-0.29C。表 4 麝香酮包合率二项式回归模型系数显著性检验表Table 4 Significance analysis for regressio
22、n equation of entrapment efficiency of muscon方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值Model 1181.75 9 131.31 126.49 0.0001A-环糊精量 781.71 1 781.74 753.06 0.0001B-蒸馏水体积 0.24 1 0.24 0.23 0.6443C-球磨时间 0.97 1 0.97 0.94 0.3652AB 19.01 1 19.01 18.31 0.0037AC 14.06 1 14.06 13.55 0.0079BC 30.42 1 30.42 29.30 0.0010A2 15.49 1 1
23、5.49 14.93 0.0062B2 235.63 1 235.63 226.99 0.0001C2 59.08 1 59.08 56.91 0.0001Residual 7.27 7 1.04Lack of Fit 6.40 3 2.13 9.84 0.0256Pure Error 0.87 4 0.22Cor Total 1189.02 16表 4 为麝香酮包合率实验方差分析结果，环糊精用量有显著性影响，而蒸馏水体积和球磨时间都无显著性差异。经 F 值检验显示总模型方程显著 ( P 0.0001 ) ，r=0.9969 ，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确的预测实
24、际情况。其校正定系数 (R2 adj) 为 0.9860，表明此模型能解释98.60%效应值变化，因此该模型拟合程度良好，试验误差小。拟合回归方程Y2=75.07+9.88A-0.17B-0.35C+2.18AB-1.88AC+2.76BC-1.92A2-7.48B2-3.75C2。而多元线性回归的相关系数 r=0.8115，其校正决定系数 (R2 adj) 为 0.5796，不如二项式回归拟合，线性方程为：Y 2 =68.89+9.88A-0.17B-0.35C。2.4 影响因素的响应面曲线图根据 Design-Expert 软件绘制不同影响因素对于响应值的三维曲线图，见图2、 图 3。图
25、2 和图 3 为分别固定三个影响因素其中之一，而考察其他两个因素对药物包合率影响的响应曲面图。由图可以看出，随着环糊精用量的增加，龙脑、麝香酮包合率显著增加，但随着球磨时间和加水量的增加，包合率有先增加后减少的趋势，但经统计分析没有差异。根据 Box-Behnken 响应面试验设计结果，并结合包合物的制备工艺，得到优化条件为：龙脑和麝香酮质量-环糊精质量比为 1:8，环糊精-水质量比为 1:4，包合时间为 53 min，龙脑和麝香酮理论包合率分别为 98.82%和 83.33%。图 2 龙脑包合率的响应曲面图Figure 2 Response surface plot of entrapmen
26、t efficiency of borneol 图 3 麝香酮包合率的响应曲面图Figure 3 Response surface plot of entrapment efficiency of muscon2.5 验证试验为了确定建立模型与实验结果是否相符，通过进一步验证实验对模型的可靠性进行评价。在验证实验中，各因素取值为上述确定的最优条件，共进行 4组实验，龙脑的包合率分别为：97.58%，97.70%，97.34%，97.03%；麝香酮的包合率分别为：81.66%，82.18%，83.09%，83.43%。实测值与理论计算值偏差均小于 2%，说明模型比较可靠。3 讨论处方中艾片和人工
27、麝香均为挥发性成分，通过环糊精包合，能够增加其稳定性。本实验采用球磨法同时包合艾片中龙脑和人工麝香中麝香酮，能到达既节约原料又节约时间的目的，更适合于工业化生产。本实验采用 Box Behnken 实验设计优化龙脑-麝香酮-环糊精包合工艺，其充分考虑到各因素的交互作用，设计方法简单，采用非线性模型拟合，复相关系数较高，验证实验结果表明，理论预测包合率与实际测定值偏差小于 2%，可信度较高。因此，最终确定醒脑静固体制剂挥发性成分包合物的制备工艺为：龙脑和麝香酮质量-环糊精质量比为 1:8，环糊精-水质量比为 1:4，包合时间为53 min；验证实验结果表明，该工艺稳定可行，艾片中龙脑和人工麝香中
28、的麝香酮的平均包合率分别为 97.41%和 82.59%。参考文献1 秦冬彦,宋洪涛,郭 涛,等.冰片 -环糊精包合物的稳定性考察J. 中草药,2000,31 (4):255-256.2 李 娟,陆 洋,王广基. Box- Behnken 效应面法优化甘草次酸长循环脂质体的处方J.中国药科大学学报,2007,38 (2) :120-124.3 邹国省 ,关浩彬,秦凌浩.Box- Behnken 响应面设计法优化替硝唑环糊精包合物的制备工艺J.广东药学院学报,2009,25(5):444-448.4 吴大章 ,吴品江 ,杨明.Box- Behnken 设计-效应面法优化紫苏叶挥发油-环糊精包合物制备工艺J.成都中医药大学学报,2009,32(1):81-87.
