1、- 1 -生物有机肥高效工程菌构建及产业化项目总结报告一、项目概况（包括项目名称、立项时间、项目编号、项目负责人、合作企业、经费预算、主要研究内容等）本项目“生物有机肥高效工程菌构建及产业化” ，是 2015 年江苏省产学研联合创新资金-前瞻性联合研究项目，项目编号为BY2015024-04，项目负责人：陈安徽，邵颖，合作企业：徐州市城北农业科技有限公司，项目总预算经费为 90 万元，其中省拨款15 万元。项目主要研究内容：筛选目标微生物，通过软 X 射线、低能离子束等方法综合选育混合菌群，将多种有益微生物构建成高效生态菌群工程菌，研究温度、有机物浓度等因素对微生物的影响，研究了有机肥的生产工
2、艺参数，确立了生物有机肥的实际应用效果，研究了有机肥产品的实际应用效果。二、项目实施情况（即完成项目过程中所做的主要工作，包括校企联合研发团队的组织、实施计划的制定与落实、企业研发人员的培养培训、项目完成情况及成效、经费预算执行情况等）研究时间为 2015 年 7 月至 2017 年 6 月，省科技厅下拨经费15 万元已全部到位，自筹经费按照合同要求匹配，资金管理使用规范，能够专款专用，经费按照合同要求使用。为了使项目顺利开展，课题组成立了校企联合研发团队，明确目标管理考核任务，责- 2 -任到人，超额完成了目标任务。已经申请发明专利 5 项，在International Journal of
3、 Biological Macromolecules 、 食品科学 、农业工程等期刊上发表科研论文 6 篇。项目通过软 X 射线、低能氮离子束结合化学诱变剂综合选育混合菌种，将多种有益微生物构建成稳定的高效生态菌群工程菌，利用菌糠等农作物下脚料生产酵素原液。利用菌糠酵素结合工、农业废弃物果渣、废糖蜜、植物秸秆等为主要原材料研制生物有机肥料。利用产品中微生物的群体优势将废弃物降解，以微生物的生命活动及代谢协同作物得到特定肥料效应。本项目产品在培肥地力、抑制农作物对重金属、农药的吸收净化和修复土壤、降低农作物病虫害发生、保护环境以及维护食品安全方面有着不可替代的作用。项目完成情况如下：1、通过土壤
4、微生物的筛选，获得具有较强脱氮性能的好氧反硝化细菌和能分解腐殖质的生物有机肥高效工程菌，并通过诱变手段选育遗传性能稳定、脱氮效果较强的亚消化细菌 Nitrosomonas sp.菌株。2、工程菌群诱变选育技术参数，软X 射线辐射的 束 流 值 控 制在 5102Gy 时 ， 致 死 曲 线 呈 现 “马 鞍 型 ”， 处 于 “马 鞍 ”的 底 部 ，表 现 出 一 定 的 刺 激 效 应 ， 故 软 X 射线辐射的 最 佳 剂 量 为5102Gy， 该 条 件 下 菌 株 突 变 率 相 对 较 高 ， DNA的 损 伤 不 是 很 严 重 ，且 具 有 良 好 的 修 复 能 力 ， 所
5、以 能 够 筛 选 到 正 突 变 率 较 高 的 菌 株 。该 剂 量 条 件 可 为 其 他 微 生 物 的 诱 变 育 种 提 高 理 论 依 据 。- 3 -3、N +离子注入有机肥高效工程菌诱变效应的研究发现，最佳N+离子注入剂量为101510 13ions/cm2 ，工程菌群SR106菌株存活率曲线是典型的“马鞍型”剂量-效应曲线，故该剂量条件为最佳条件。4、在本试验条件下，经紫外诱变即获得遗传性状稳定、腐殖质分解能力强正向突变菌群U29。由结果同时可以看出有机肥高效工程菌菌株经软X射线和N +离子注入选育后，再经紫外诱变，菌群分解腐殖质的能力依然有较大的提升空间，也从另一方面反映
6、了综合诱变育种的方法在有机肥高效工程菌的菌种选育中是可行的，这也为其他相关微生物诱变育种提供了一定的参考依据。5、菌群 U29 经微波诱变后获得的新菌株，选择生长速度较快，堆肥发酵升温相对较快的几株菌株作为试验菌株进行培养。结果可见菌群 W26 活性较强且遗传稳定性研究。6、 以果渣和稻草（废弃秸秆）为主要原料，研究了不同菌糠酵素添加方式对有机肥发酵及质量的影响。测定了有机肥发酵过程中发酵温度、有机质含量、总氮含量、总磷含量、总钾含量、酸碱度、腐殖酸总量、粗纤维含量等营养指标，以及微生物菌群数量和蛔虫卵死亡率等。结果表明，3 种不同菌糠酵素添加方式处理的有机肥的有机质、总养分指标都高于国家标准
7、（有机质45%，总养分5%） ，但发酵前期分次添加菌糠酵素能提高有机肥的总氮、总磷含量，提高发酵温度和高温的天数，并增加有机肥中的有效活菌数。总之，分次添加菌糠酵素处理有助于提高有机肥的发酵质量。- 4 -7、为研究开发的有机肥应用效果，研究富硒有机肥对大蒜中硒含量的影响。试验建立高分辨-连续光源石墨炉原子吸收光谱法（HR-CS GFAAS）测定富硒大蒜中不同形态硒含量的方法，研究富硒有机肥对大蒜中硒元素及其形态的影响。通过单因素实验优化得出硒元素最佳测定条件，即最佳基体改进剂为 Pd(NO3)2 (1 g/L)和 Mg(NO3)2 (0.5 g/L)混合溶液，且最佳添加体积为 5 L。参照标
8、准 DBS42/002-2014 制备出富硒大蒜总硒和无机硒测定试样，再使用 HR-CS GFAAS 法测定总硒含量为 8.933 g/g9.476 g/g，无机硒含量为 5.784 g/g 6.021 g/g，计算出有机硒含量为 3.124 g/g3.491 g/g，所占百分比为 34.16%36.84%，这说明富硒有机肥能有效提高大蒜中总硒和有机硒的含量。总硒和无机硒的加标回收率分别为 96.3%和 93.7%，这表明参照DBS42/002-2014 分析富硒大蒜中硒元素含量及其形态，结果准确可靠，添加的标样（无机硒）几乎全部在待测无机硒试样中。该方法快速、准确、稳定，具有较高的实用价值，
9、为分析食品中微量元素含量及其形态提供科学依据。三、项目技术情况（即项目的研究方法及技术路线，项目解决的关键技术、取得的突破性进展及创新点等）1. 项目的研究方法及技术路线研究方法：本研究将通过土壤微生物的筛选，获得具有较强脱氮性能的- 5 -好氧反硝化细菌和能分解腐殖质的生物有机肥高效工程菌，同时通过生理生化反应、分子生物学鉴定、并通过诱变手段选育遗传性能稳定、脱氮效果较强的微生物菌群。在采用秸秆、动物粪便等进行有机肥生产过程中，经有机质含量，总养分及发酵周期等方面，与现有生产有机肥工艺相比，该项目技术先进、科技含量高，形成自主知识产权，市场前景广阔。以离子注入机辐照装置为技术平台，结合复合诱
10、变方式，对有机肥工程菌中微生物菌群进行诱变，选育出高产菌株；经堆积发酵培养，实现高产菌群的持续、循环利用，获得高效生产所需的相关技术参数。有机肥产品实际应用效果的研究，通过考察有机肥对产品品质的影响，建立高分辨-连续光源石墨炉原子吸收光谱法（HR-CS GFAAS）测定富硒大蒜中不同形态硒含量的方法，研究富硒有机肥对大蒜中硒元素及其形态的影响，该方法快速、准确、稳定，具有较高的实用价值，为分析食品中微量元素含量及其形态提供科学依据。技术路线：消化细菌、亚硝化细菌、土著微生物的筛选分离生理、生化反应检测及分子生物学鉴定 软 X 射线、低能离子束等诱变选育构建有机肥高效菌群 有机肥生产工艺研究中试
11、及检测分析实际应用效果评价以土壤中筛选分离的快速分解腐殖质的微生物及亚硝化细菌菌- 6 -株为出发菌株，采用不同能量和剂量的软 X 射线、低能离子注入菌体中，进一步筛选活性菌群进行紫外线及微波诱变处理菌株遗传性状稳定性检测筛选到的菌群进行有机肥发酵实验，根据产品中有害物质的分解率、害虫虫卵的数量、有机质含量及总养分等指标，确定物料添加方式、接种量、培养时间、温度、pH 值、循环利用次数、保存条件对有机肥进行中试发酵有机肥的实际应用效果及对农产品品质的影响。2. 项目解决的关键技术(1)高效工程菌群的构建。通过软 X 射线、低能氮离子束结合化学诱变剂综合选育混合菌种，将多种有益微生物构建成稳定的
12、高效生态菌群工程菌。主要解决工程菌群选育的方法和参数问题。(2)生产工艺优化研究微生物菌株发酵温度、pH 值、氧化还原电位、水力停留时间（HRT） 、有机物浓度及反应器类型、发酵方式等条件对微生物的影响，通过单因素及正交试验优化生产工艺条件，确定有机肥的发酵工艺。研究产品配方工艺，并对产品进行中试及产业化，设计产业化生产线。(3)应用参数的确立研究产品对不同作物生长及产品品质的影响，确立产品的实际应用参数。主要解决产品的使用量、使用方法。3. 取得突破性进展- 7 -（1）通过采集、筛选土著微生物，经过微生物扩培、人工诱变选育、发酵工艺优化等技术手段构建具有较强的农污染物降解效力的有机肥生产工
13、程菌群。通过土壤微生物的筛选，获得脱氮效果较强的亚消化细菌 Nitrosomonas sp.菌株，通过人工诱变选育研究结果发现菌群 W26 活性较强且遗传稳定性有机肥生产工程菌群。（2）确立软 X 射线辐射的最佳剂量为 5102Gy，最佳 N+离子注入剂量为 101510 13ions/cm2。（3）有机肥发酵过程中前期分次添加菌糠酵素能提高有机肥的总氮、总磷含量，提高发酵温度和高温的天数，并增加有机肥中的有效活菌数，此种工艺生产的有机肥中有机质、总养分指标都高于国家标准（有机质45，总养分5） 。（4）研究开发的有机肥应用效果，成功建立了高分辨-连续光源石墨炉原子吸收光谱法（HR-CS GF
14、AAS）测定富硒大蒜中不同形态硒含量的方法，研究富硒有机肥对大蒜中硒元素及其形态的影响。经测定发现大蒜总硒含量为 8.933 g/g 9.476 g/g，无机硒含量为 5.784 g/g6.021 g/g ，计算出有机硒含量为 3.124 g/g3.491 g/g ，所占百分比为 34.1636.84，这说明富硒有机肥能有效提高大蒜中总硒和有机硒的含量。4. 创新点（1）通过软 X 射线、低能氮离子束结合化学诱变剂综合选育混合菌种，消除目标微生物间的拮抗作用，将多种有益微生物构建成稳定的高效生态菌群工程菌，应用于农作物下脚料的降解，该技- 8 -术拥有独立的知识产权，项目具有显著的特色和创新性
15、。（2）将菌糠等农作物下脚料加工成酵素，创造性的将菌糠酵素结合果渣、秸秆、费糖蜜结合煤矸石等工业废料开发成新型高效有机肥。产品中富含大量活菌、不含有任何化学肥料，其肥效的发挥完全靠其所含有多种特定功效的有益微生物(固氮、解磷、解钾等) 分解煤矸石、粉煤灰等物质，使用后产品中的有益菌群能较好的宿存于土壤中，较好的发挥益生菌的特定功效。（3）项目快速检测系统的建立，能实时检测微生物菌群的种群及个体数量，监测目标菌株的流向，同时也可快速监测土壤中微生态环境。本项目通过构建个体特异性的方法建立微量元素检测系统。该技术成果在生物有机肥研究领域属原创新成果，具有一定的创新性。四、合同任务指标完成情况（实际
16、完成合同约定的研究内容、技术指标、效益指标、工作指标等情况）科技合同所规定的各项考核指标目前已经完成，其中已完成 5项发明专利申报，已发表科研论文 6 篇文，获得利用基因工程群，完成了小试研究，获得成熟的小试样品，中试试验及产业化工艺，其余合同规定任务完成情况均达到预期目标。五、项目绩效分析（包括经济效益、社会效益分析，市场应用前景分析，对促进社会发展、科技进步和企业创新能力提升的作用等）- 9 -生物有机肥每年都存在巨大的市场缺口，目前其市场价值已达到数十亿美元，预计有机肥的市场潜力高达数180亿美元，针对这一商业契机，有机肥的生产即将成为化肥资源之后新平台产品的研究热门。国内外研究机构争先
17、展开深入的研究，如无公害生态农业、绿色食品工业和环境部门成员及大型公司陆续宣布其新的微生物肥料开发取得突破，该工艺可将农业、工艺废弃物无害化处理后，转变为生物有机肥。新工艺将采用非常廉价、清洁的农业原料代替化学肥料来生产农产品。相比化学肥料，微生物法生产有机肥具有选择性好，转化率高，有利于修复土壤，无环境污染问题，可利用再生资源等优点，是一种技术上可行，经济上有竞争力的生产方法。可有效避免化学工艺中产生的能耗高、污染大、副产物多等不利因素。同时由于有机肥是微生物细胞分解产物，是在微生物体在特定元素循环下得到的副产物，因此发酵得到的有机肥具有立体专一性。国际上发达的国家已经实现了生物基转化有机肥
18、的产业化，且作为生物基平台生产其它绿色农、畜禽产品，已被广泛应用于绿色食品、生物材料和无公害产品品等行业，成为国民经济生产中不可缺少的重要原材料。在国际上，采用微生物转化和工程菌无害化处理工农业废弃物已成主流技术，利用微生物发酵生产有机肥可有效的避免化学合成法所带来的不利因素，且具有生产周期短，原料丰富，绿色环保，生产成本低等优势，可以生产经济价值较高的绿色- 10 -农产品。不断地进行现有技术的改进和创新，解决生产中的环境保护、降低生产成本和扩大产业化规模等已成为当今该技术领域中的研究重点。我国研究开发由生物基无害化处理农业副产物及垃圾，特别是权威研究机构与企业结合，可以大大缩短研究产业化的
19、时间，极大提高成果产出和转化的速度，加快实现经济社会效益的步伐，在短时间内缩短我国与国际先进技术的距离，提高我国在绿色农产品研发的国际学术地位和生产技术水平。课题组在本研究中，通过采集、筛选土著微生物，经过微生物扩培、人工选育、发酵工艺优化等技术手段构建具有较强的农污染物降解效力的有效微生物菌群，并使用筛选出的有效微生物菌群成功开发生物有机肥；另外，利用构建的工程菌群进行人工发酵过程代替自然发酵开发了以农村种植废弃物如秸秆、麸皮、菌糠为主要原料的高效生物有机肥，研究了有机肥的发酵工艺并检测了超氧化物歧化酶（SOD ）、纤维素酶等功效酶的活性；生物有机肥的应用效果评价。该工艺技术实现低成本、高质量和生产过程与环境友好地生产有机肥，为企业带来经济效益。产品销售1650吨（1850元/吨），产值305.25万元，利税132.75万元。六、存在问题、有关建议及下一步研究设想利用诱变选育的方法构建生产工程菌群的方法生产有机肥，生产成本低，产品工艺技术先进，产品质量高性能好，可以推广到农业种植、水产养殖、农业废弃物处理、污染物处理、土壤改良等产
