1、 1米发糕的体外模拟胃肠消化特性研究 1陈晨 1 贾才华 1 赵思明 1 格桑卓玛 1 张宾佳 1 牛猛 1 熊善柏 1 林亲录 2（华中农业大学食品科学技术学院 1，武汉 430070）（中南林业科技大学食品科技与工程学院 2，长沙 410004）摘 要 以不同菌种制作的四种米发糕为原料，采用体外模拟消化方法，研究其胃肠水解物的成分及其抗氧化活性，为米发糕营养评价提供依据。结果表明，发酵微生物种类对米发糕胃肠水解物的组成及抗氧化活性有显著影响。胃肠水解物中的肽具有良好的OH 清除能力和 Fe2+螯合能力，以酵母菌 ZSM-001 和乳酸菌 ZSM-002、安琪酒曲和酵母粉发酵制作的米发糕胃肠
2、水解物中的可溶性肽含量较高。胃肠水解物中的蛋白质具有良好的OH 清除能力和还原能力，酵母菌 ZSM-001 和米根霉 ZSM-003 发酵制作的米发糕，其 胃肠水解物的还原能力较强。可溶性糖的 Fe2+螯合能力最强，以安琪酵母和酒曲制作的米发糕胃肠水解物的可溶性糖含量最高。关键词 米发糕 水解物 体外消化 抗氧化活性中图分类号：TS213.3 文献标识码：AThe Characteristics of External Gastrointestinal Hydrolyzates of Fermented Rice Cake Chen Chen1 Jia Caihua1 Zhao Siming1
3、 Gesanzhuoma1 Zhang Binjia1 Niu Meng1 Xiong Shanbai1 Lin Qinlu2(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University1, Wuhan 430070)(School of Food Technology and Engineering, Center South University of Forestry and Technology2, Changsha 410004)Abstract The composition and anti-o
4、xidant activity of gastrointestinal hydrolyzates obtained from four kinds of rice cake fermented with different strains were studied by vitro simulated digestion, which provided the basis for evaluating the nutrition of fermented rice cake. The results showed that the species of microorganisms had s
5、ignificant effects on the composition of gastrointestinal hydrolyzates and antioxidant activity of fermented rice cake. The ability of hydroxyl radical scavenging and Fe2+ chelating of peptides in gastrointestinal hydrolyzates was good, and the content of soluble peptides in gastrointestinal hydroly
6、zates of rice cake fermented by yeasts (ZSM-001) and lactic acid bacteria (ZSM-002), Angel rice leaven and dry yeast respectively was high. The OH radical scavenging capacity and reducing ability of protein was good, and the reduction ability of gastrointestinal hydrolyzates in rice cake fermented w
7、ith yeast (ZSM-001) and rice rhizopus (ZSM-003) was strong. The Fe2+ chelating ability of soluble sugar was strong, and the soluble sugar content of fermented rice cake made from Angel dry yeast and rice leaven was the highest.Key words Fermented rice cake, gastrointestinal hydrolyzates, in vitro di
8、gestion, antioxidant activity食品中的多糖、蛋白质等大分子物质在人体内不可被直接消化，然而经体内酶、pH 等作用，可降解为小肽、游离氨基酸、单糖等易被消化吸收的物质 1。食物胃肠消化物的营养成分可作为膳食营养评价的重要手段。米发糕经胃肠消化后，产生小分子活性肽、低聚糖等成分，易被肠道消化吸收而直接在机体内起作用。经不同菌种发酵后，由于微生物产基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2662017QD004）收稿日期：2018-02-01作者简介：陈晨，女，1994 年出生，硕士，食品科学通讯作者：贾才华，男，1983 年出生，讲师，食品大分子结构及功能特性
9、研究2生的酶对米发糕营养物质的作用位点不同，使得其营养成分如肽和糖的组成和结构有差异，导致其生物活性不同 2。消化使米发糕蛋白质得到充分的降解，在胃肠消化物中暴露出更多具有抗氧化作用的基团 3。组氨酸、某些酸性氨基酸侧链和多糖结构中的醇羟基 4均可以与产生OH 等自由基所必需的金属离子(如 Fe2+、Cu 2+等)络合，具有抗氧化作用；Trp和 Tyr 等具有供氢能力的氨基酸可将氢原子给予自由基，导致自由基链反应减慢或终止，从而起到抗氧化的作用 5。本文以实验室前期研发的专用菌株，以不同组合的发酵剂，发酵制作米发糕，研究发酵剂对米发糕胃肠消化物及活性的影响，探索产生抗氧化活性的机理，确定具有高
10、抗氧化活性的发酵剂。为传统米发糕的营养特性进行科学评价提供参考。1 材料与方法 1.1 材料大米粉（粉状） ，由岗优 118 型籼米浸泡磨粉制成，收获于 2015 年：黄冈东坡粮油集团；羟丙基二淀粉（粉状）：杭州普罗星变性淀粉有限公司；马铃薯预糊化淀粉（粉状）：北京远大食品添加剂有限公司；白砂糖（颗粒状）：市售；安琪耐高糖活性干酵母和甜酒曲（甜味型）：宜昌安琪酵母股份有限公司；ZSM-001 卡斯特酒香酵母 6、ZSM-002 植物乳杆菌 7、ZSM-003 米根霉 8，保藏于中国典型培养物保藏中心（ CCTCC） ，于 2016 年取出，菌株均为冻干菌粉，用前需在固体培养基中活化，并在液体培
11、养基中扩大培养，获得菌泥作为米发糕发酵剂。1.2 主要试剂盐酸，氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、菲咯嗪、邻二氮菲、乙醇：国产分析纯；DPPH ，胃蛋白酶，胰酶，抗坏血酸：sigma 公司。1.3 主要仪器与设备TDL-5A 型离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；HBSHP-150 型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；722S 型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。1.4 方法1.4.1 米发糕的制作以大米粉、发酵剂（分别为 ZSM001、ZSM001 与 ZSM002、ZSM001 与 ZSM003、安琪酵母与酒曲） 、白砂糖、水等为原料，搅拌均匀，于 35发酵 12h 后，
12、注模蒸制而成。1.4.2 米发糕水解液的制备1.4.2.1 水提液制备米发糕捣碎加入去离子水（15） ，37 摇床 4 h 后置于沸水浴中 10 min，快速冷却。离心（4 000 r/min，20 min） ，过滤，取上清液。1.4.2.2 体外模拟胃消化过程米发糕捣碎加入去离子水（15） ，用 1.0 mol/L 盐酸调节 pH 至 2.0，加入胃蛋白酶（米发糕蛋白质量的 4） ，37 摇床恒温消化 2 h。2 h 后取样，pH 值迅速调为 7.0，置于沸水浴中 10 min 灭酶，快速冷却。离心（4 000 r/min，20 min ） ，取上清液。1.4.2.3 体外模拟胃肠消化过程米
13、发糕经过胃消化道酶系消化 2 h 后，用 1.0 mol/L 氢氧化钠调 pH 值至 7.5。然后加入胰酶（加量为米发糕蛋白质量的 4%） ，在 37 摇床恒温消化 2 h。pH 值迅速调为 7.0，置于沸水浴中 10 min 灭酶，快速冷却，离心（4 000 r/min，20 min ） ，取上清液。1.4.3 米发糕水解物成分测定1.4.3.1 可溶性蛋白质含量的测定取 5 mL 米发糕水解液，至 50 mL 离心管，加入少许蒸馏水，均质后定容至 40 mL，4 000 r/min 离心 10 min，取上清液用 Folin-酚试剂法进行测定。31.4.3.2 可溶性肽含量的测定用双缩脲比
14、色法测定米发糕水解液的肽含量 9。1.4.3.3 游离氨基酸含量的测定取液体样品 510 mL，加 50 mL 蒸馏水和 5 g 左右活性炭，加热煮沸并过滤，用热水洗涤活性炭，收集滤液于 100 mL 容量瓶中。吸取样品溶液 14 mL 于 50 mL 比色管中，加 pH 5.4 乙酸和乙酸钠缓冲液和 2%茚三酮溶液各 1 mL，加 0.1 mL 抗坏血酸，沸水浴 15 min，室温静置 15 min 之后，在 570 nm 下检测吸光值 10。1.4.3.4 总糖含量的测定吸取一定量的样品于 100 mL 锥形瓶中，加 5.0 mL 50% HCl，混匀，于 70 水浴锅中水解 15 min
15、，冷却，调 pH 为 7，定容 100 mL。吸取样品水解液 1 mL 于 25 mL 比色管中，按照 3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量 11。总糖 （%）= （还原糖质量稀释倍数100）/ 样品体积100%1.4.4 米发糕水解物的抗氧化活性的测定1.4.4.1 DPPH 自由基清除能力取 1.5 mL 样品溶液，加入 1.5 mL 99.5的乙醇和 0.675 mL 的 0.02DPPH 乙醇溶液混合，振荡混匀，室温下避光水浴 30 min，然后在 517 nm 下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除 DPPH能力越强。空白即是将 1.5 mL 样品溶液换成 1.5 mL 去离子水
16、12。清除 DPPH能力（%）=（空白吸光值 -样品吸光值 ）/空白吸光值 100%1.4.4.2 OH 自由基清除能力取 1.0 mL 样品溶液，加入 1.0 mL 0.75 mmol/L 邻二氮菲和 2.0 mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液，加入 1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4，混合均匀，加入 1.0 mL 0.12% H2O2，37 水浴保温 60 min，蒸馏水调零测定 536 nm 处吸光值。羟自由基清除率（%）= (AS-AP)/AB100%式中： AS，样品吸光值；AP，1.0 mL 蒸馏水代替样品，其他反应条件相同；AB，用 2.0 mL 蒸馏水代替样品和 0
17、.12% H2O2。1.4.4.3 亚铁离子螯合力的测定取 1 mL 的样品溶液，加入 3.7 mL 乙醇和 0.1 mL 2 mmol/L 的 FeCl2 溶液混合，再加入0.2 mL 5 mmol/L 的菲咯嗪溶液启动反应。室温静置 10 min 后，在 562 nm 波长处检测吸光度。亚铁离子螯合能力=（空白吸光值-样品吸光值）/空白吸光值100%1.4.4.4 还原能力的测定取多肽溶液 1 mL，加入 0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）2.5 mL 和 1%的铁氰化钾溶液 2.5 mL，充分混和以后，在 50 下，保温 20 min 后加入 2.5 mL 10%的三氯乙
18、酸。经充分混合后以 3 000 r/min 离心 l0 min。取上清液 2.5 mL，加入去离子水 2.5 mL 和 0.1 % FeCl3 0.5 mL，混匀后，测定反应液在 700 nm 处的吸光度值。1.5 数据统计分析所有数据采用 Excel2013 与 SAS9.2、SPSS22.0 软件进行处理和分析。其中显著性分析采用 SPSS 处理，p0.05 判定为变化显著；相关性分析用 SAS 处理；所有图表均由Excel 处理。2 结果与分析2.1 米发糕胃肠消化物的营养成分2.1.1 米发糕胃肠消化物中可溶性蛋白质含量米发糕水解液在不同消化阶段的可溶性蛋白质含量见图 1。其中，水提液
19、的可溶性蛋白质含量最低，其中 JR 的可溶性蛋白质含量最高，其次为 J、JG、AJ。这是由于乳酸菌对4米发糕蛋白质的降解作用强于酵母菌和根霉菌 13。乳酸菌在短期内迅速繁殖，所产蛋白酶和酸可促使部分蛋白分解和溶出，其所产乳酸是具有 -羟基结构的羧酸，能与多肽链上的基团形成氢键，也会促进蛋白的溶出 14。胃消化阶段，在胃蛋白酶和酸的作用下，米发糕蛋白质降解，水解为可溶性蛋白和小肽等，消化物中可溶性蛋白质含量相比水提液均有显著增长，以 JR 蛋白质含量最高。在胃肠消化后，J 和 JR 的蛋白质含量略有下降，而 JG和 AJ 的蛋白含量增加。注：大写字母表示同一消化阶段不同种类米发糕间有差异，小写字
20、母表示同种米发糕不同消化阶段间有差异（p0.05） 。J 为酵母菌发酵制作的米发糕，JR 为酵母菌和乳酸菌发酵制作的米发糕，JG 为酵母菌和米根霉发酵制作的米发糕，AJ 为安琪酵母和甜酒曲发酵制作的米发糕。余同。图 1 米发糕水解液中可溶性蛋白质含量2.1.2 米发糕胃肠消化物中可溶性肽含量发酵过程微生物代谢产生的蛋白酶系和酸促使体系中蛋白质降解，产生小分子多肽。由图 2 知，米发糕水提液的肽含量与蛋白质含量相比较高，以 J 的肽含量最高，经过胃消化，胃蛋白酶和酸性条件使蛋白质进一步降解，JR、JG、AJ 肽含量相比水提液显著增加，以 JR 的肽含量最高。胃肠消化阶段，胰酶中的胰蛋白酶继续降解
21、蛋白，J、JG、AJ 米发糕肽含量与胃消化阶段比显著增加，而 JR 米发糕肽含量降低，可能是由于胰酶作用，小分子多肽继续降解成氨基酸导致 15。5图 2 米发糕水解液中可溶性肽含量2.1.3 米发糕胃肠消化物中游离氨基酸含量由图 3 可以看出，J、JR 、JG、AJ 水提液的游离氨基酸含量较低，经过胃消化，游离氨基酸含量均显著增加，以 JR 的游离氨基酸含量最高，其次为 AJ、JG、J。在胃肠消化阶段，游离氨基酸含量大幅度增加，以 AJ 的氨基酸含量最高，其次为 JR。米发糕水提液中的游离氨基酸主要来自于发酵过程中，微生物代谢产生的蛋白酶对大分子蛋白和肽类物质的降解 16，含量较低。在胃部消化
22、过程中游离氨基酸的释放较少，而在肠道消化过程中释放了大量游离氨基酸，说明胰酶对多肽的降解作用较强。图 3 米发糕水解液中游离氨基酸含量2.1.4 米发糕胃肠消化物中可溶性总糖含量 由图 4 可知，水提组和胃消化组的四种米发糕可溶性总糖含量差异不显著，而在胃肠消化阶段，J、JR 、JG、AJ 可溶性总糖含量均显著升高且具有显著性差异，其中 AJ 总糖含量最高，其次为 JR、J 、JG。由于胃蛋白酶和酸对淀粉降解作用不明显，而胰酶中含有胰6淀粉酶，对米发糕中的淀粉有酶解作用，使得从淀粉上脱落下的单糖、二糖等含量增多，使得水解液中可溶性总糖含量大幅度提高 17。图 4 米发糕水解液中总糖含量2.2
23、米发糕胃肠消化物的抗氧化活性2.2.1 DPPH 自由基清除能力不同浓度 Vc 溶液以及四种米发糕水解液的 DPPH清除能力如图 5。米发糕水解液的DPPH清除能力与 0.0060.01 mg/mL Vc 溶液相当。J、 JR、AJ 在水提组、胃消化组、胃肠消化组的 DPPH清除能力变化规律相似，且差异不显著。其中，AJ 的 DPPH清除率清除最低。水提液组，JR 的 DPPH清除率最高（42.7% ） ；胃、胃肠消化消化组中 JG 的清除能力均最高，表明酵母菌和根霉菌制作的米发糕能够在胃肠消化液暴露出较多的供氢基团，与自由基作用，表现出较强的自由基清除能力 18。图 5 米发糕水解液的 DP
24、PH 自由基清率2.2.2 羟基自由基清除能力Aa7不同浓度 Vc 溶液以及四种米发糕水解液的OH 清除能力如图 6。米发糕水解液的OH 清除能力与 0.010.04 mg/mL Vc 溶液相当。水提液组，JR 清除OH 的能力最强；经过胃蛋白酶消化后，J、JR 、 JG、AJ 的OH 清除率均显著提高，分别提高到29.40%、32.19%、25.36% 、31.47%；进一步用胰酶消化后，JG 和 AJ 清除OH 的能力仍在进一步的提升，但 J、JR 的清除率有所下降，清除率最高的为 JR 。表明酵母菌和乳酸菌制作的米发糕水解物富含供氢体，可清除或抑制自由基 19。图 6 米发糕水解液的羟自
25、由基清除率2.2.3 亚铁离子螯合能力如图 7，米发糕水解液的 Fe2+鳌合能力与 0.0010.006 mg/mL EDTA 溶液相当。水提组中，AJ 的 Fe2+鳌合能力最强 ，其次是 JG、JR 、J。胃消化后，Fe 2+鳌合能力均增强，其中最高的是 JR，其次为 JG。胃肠消化后，JR、JG、AJ 鳌合 Fe2+的能力升高，而 J 降低。其中，Fe 2+鳌合能力最强的是 AJ，其次为 JR。蛋白质的酸性氨基酸侧链羧基、多糖的酚羟基、组氨酸等可以与 Fe2+形成螯合物，减少机体自由基的产生 20。表明安琪酒曲和酵母粉、酵母菌和乳酸菌复合制作的米发糕的胃肠水解物中这些活性物质较多。8图 7
26、 四种米发糕水解液的 Fe2+鳌合能力2.2.4 还原能力反应体系在 700 nm 处吸光度越大，说明样液还原能力越强 21。如图 8 所示，米发糕水解液的还原能力接近于 0.010.06 mg/mL Vc 溶液的还原能力。 水提组中，JR 还原能力最高，其次为 JG；经胃消化后，还原能力均显著增加，其中 JR 还原能力最强，其次为JG、 AJ；经胃肠消化后，J 、 JR 还原能力下降，而 JG、AJ 的还原能力略有升高。其中，JG 还原能力最高。发酵时微生物所分泌的各种酶类物质如蛋白酶、糖化酶，加上消化过程，胃蛋白酶和胰酶的作用，使样品产生更多的还原糖、小肽和氨基酸等物质，使样品还原能力有不
27、同程度的提高 22。图 8 四种米发糕水解液的还原能力2.3 米发糕胃肠水解物成分和抗氧化活性的相关性米发糕水提和胃肠消化过程中的蛋白质、多肽、氨基酸、总糖含量与抗氧化活性的相关性如表 2 所示，OH 清除能力与蛋白质和肽含量呈极显著正相关关系，与游离氨基酸含量有正相关性，与总糖相关性不大。Fe 2+螯合能力与蛋白质、游离氨基酸、总糖含量显著9正相关，与肽含量有正相关性。还原能力与蛋白质含量极显著相关，与肽含量正相关；DPPH清除能力与蛋白质、多肽、氨基酸、总糖含量相关性不大。结果表明，米发糕胃肠水解物中的可溶性蛋白质和可溶性肽对清除OH 作用最强 23，游离氨基酸和可溶性总糖对螯合 Fe2
28、作用最强，其对清除 DPPH 自由基作用均不显著 24。表 1 米发糕胃肠水解物成分与抗氧化活性的相关性分析胃肠水解物成分名称 DPPH清除能力 OH 清除能力 Fe2+螯合能力 还原能力可溶性蛋白质 0.470 0.927* 0.617* 0.738* 可溶性肽 0.240 0.725* 0.522* 0.512* 游离氨基酸 0.277 0.535* 0.625* 0.319 可溶性总糖 0.086 0.451 0.630* 0.147 注：*表示有相关性 0.05p0.1，*表示有显著相关性 0.01p0.05，*表示有极显著相关性p0.01。3 结论微生物发酵和胃肠道消化有利于大分子物
29、质降解，促进易于人体吸收的小分子活性物质产生。米发糕胃肠消化物中的水溶性蛋白、肽、游离氨基酸、可溶性糖对OH 清除能力、Fe2+螯合能力、还原能力有不同程度的提高，而对 DPPH的清除作用不大。胃肠水解物中，以水溶性蛋白含量较高时，OH 清除能力、还原能力作用最强，水溶性糖含量较高时，Fe2+螯合能力最强。分子量较大的蛋白水解物的抗氧化作用较强。采用酵母菌和乳酸菌、酵母菌和米根霉作为发酵剂，可制得抗氧化活性较高的米发糕。参考文献1马玉荣.加热及模拟胃肠道消化处理对豆浆活性成分和抗氧化能力的影响D. 广州: 华南理工大学, 2014:9MA Y R. Effect of heating and
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