1、分子病理检测平台 -原位杂交,病理科张朋新2017年3月8日,原位杂交原理及实验过程原位杂交的应用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda荧光原位杂交的原理及探针类型荧光原位杂交的应用1.实体性肿瘤2. 淋巴造血系统肿瘤3. 产前诊断,原位杂交原理,核酸分子杂交（nucleic acid hybirdzation）：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。杂交双方分别为待检的核酸序列和已知的核酸序列，后者常用核素和非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成异源性双链分子称为杂交体。生命科学的“钓鱼” 。,DNA,制片,原位杂交原理及实验过程原
2、位杂交的应用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda荧光原位杂交的原理及探针类型荧光原位杂交的应用1.实体性肿瘤2. 淋巴造血系统肿瘤3. 产前诊断,普通原位杂交（ISH）,用途： 检测DNA及RNA表达的情况，辅助病学学诊断检测项目：1. EBV病原EBER原位杂交检测2. HPV病原体低危6/11和高危16/18原位杂交检测3. Kappa和lambda克隆性分析原位杂交法检测检测结果分析：仅为细胞核着色。只有当核分裂时可以出现细胞质阳性着色。,1、EBER检测：潜伏性 EBV感染与几种情况相关：鼻咽癌、淋巴组织疾病（霍奇金淋巴瘤、 Burkitt淋巴瘤、 NK/T细胞淋巴瘤、血
3、管免疫母细胞淋巴瘤、肠病T细胞淋巴瘤、免疫抑制剂患者淋巴瘤、淋巴样肉芽肿、传染性单核细胞增多症等）。一旦感染EBV，受感染者终身带病毒。EBV具有感染和转化B细胞特性，能使小淋巴细胞转变成永生的类淋巴母细胞的特征。,2、HPV检测：HPV感染与生殖器疣、宫颈癌相关（12个低危型、15个高危型）。HPV原位杂交检测；低危HPV6/11、高危16/18型。,3. Kappa 及Lambda检测轻链限制性或者单克隆性可用于区分B细胞反应性增殖和肿瘤性增殖。,原位杂交原理及实验过程原位杂交的应用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda荧光原位杂交的原理及探针类型荧光原位杂交的应用1.实体性肿
4、瘤2. 淋巴造血系统肿瘤3. 产前诊断,FISH探针种类,FISH探针种类,原位杂交原理及实验过程原位杂交的应用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda荧光原位杂交的原理及探针类型荧光原位杂交的应用1.实体性肿瘤2. 淋巴造血系统肿瘤3. 产前诊断,荧光原位杂交（FISH）,原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交用途：检测基因异常1.基因片段扩增 2.基因片段缺失 3.基因片段易位FISH技术的应用：1.靶向药物筛选 2.危险人群筛查3.风险预测分析 4.辅助诊断,FISH检测项目,1.实体性肿瘤Her-2基因检测，指导Herceptin分子靶点的治疗；EGFR基
5、因扩增检测，指导肺癌、肠癌分子靶点治疗；ALK基因易位检测，指导肺癌分子靶点治疗；检测尿脱落细胞染色体非整倍性，用于膀胱癌的诊断、复发判断；检测宫颈癌肿瘤细胞TERC基因扩增，判断CIN病变的演进风险等。2.淋巴造血系统疾病淋巴瘤诊断分型，检测特异染色体易位，协助淋巴瘤分类；慢性粒细胞白血病等白血病及多发性骨髓瘤FISH检测，判断预后等。3.产前诊断唐氏综合症（21三体）等产前染色体数目检测，协助产前诊断。,计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。杂交不均匀的区域不要分析。背景深影响信号判断的区域不要分析。在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位（
6、需由病理科医师认定）如果超过25的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。如果超过10的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。,结果判读、分析,FISH结果观察流程,观察程序：首先在HE染色切片上确认癌细胞区域；然后在10物镜下，于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构，仔细观察信号；在40物镜下扫描整张切片，观察是否存在表达的异质性，以及标本的质量，满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号；在100物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。,实体肿瘤FISH应用,1.乳腺癌Her-2/neu基因扩增检测,HER2/CEN-17 1.8-2.2 临界需重新再
7、进行另外20个的细胞计数或重新FISH检测，如仍不确定，则建议临床结合IHC检测HER2蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。CEN-17多体性：计数20个细胞内绿信号的均值。CEN-17均值3.76 高多体性,石蜡切片（ASCO/CAP 2013指南）,计数至少30个细胞，统计Ratio值（Ratio值30个细胞核中红/绿）。 Ratio2.0或者2.0但HER-2信号数为6.0，结果为阳性，提示基因扩增； Ratio2.0且HER-2信号数4.0为阴性结果，提示样本无基因扩增； Ratio2.0且4.0HER-2信号数6.0时结果为不确定，可以选择增加计数细胞至100个,或重做FISH实验来判
8、断最终结果。若红信号明显成簇或成团，判断为扩增。,乳腺癌HER-2 FISH评分标准,2. 胃癌Her-2/neu基因扩增检测,胃癌HER-2 FISH评分标准,胃癌HER-2检测指南：计数至少30个细胞，统计Ratio值（Ratio值30个细胞核中红/绿）。 Ratio2.2或者HER-2信号簇状，结果为阳性，提示基因扩增； Ratio1.8为阴性结果，提示样本无基因扩增； Ratio在1.8-2.2时，选择增加计数细胞至100个,若Ratio 2.0，判断为阳性，若Ratio 2.0，判断为阴性。必要时重做FISH实验来判断最终结果。,3. 肺癌EML4-ALK基因融和检测,肺癌EML4-
9、ALK检测指南：计数至少50个肿瘤细胞1.无ALK基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；2.在ALK基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色分离（两个信号之间的间隔大于两个信号的直径），如果50个肺癌细胞中至少有25个存在分离信号，则为ALK FISH阳性；3.在ALK基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色分离（两个信号之间的间隔大于两个信号的直径），如果50个肺癌细胞中分离信号为525个，则需重复计数50个细胞，累计100个细胞中超过15个存在分离信号（=15%）则为ALK FISH阳性；,肺癌EML4-ALK FISH评分标准,4. 其他实
10、体肿瘤FISH应用,1.TOP2A/CSP17 (乳腺癌)：指导化疗药物蒽环类应用2. EGFR/CDP17(肺癌)：指导靶向药物应用3.C-MET(肺癌)：指导靶向药物的应用4.TERC/CSP3 (宫颈癌)：判断CIN病变的演进风险分级，早诊5. CSP3/CSP7 、P16/CSP17(膀胱癌)：膀胱癌的早诊、复发判断；6.PTEN/CEN10 、FGFR1/CEN8 、ERG（前列腺癌）：判断预后、早诊7.1p36/1p25 、19q13/19p13、N-Myc/2q11（神经母细胞瘤、神经胶质瘤）：辅助诊断、判断预后、指导化疗方案应用、8. PTEN/CEN10（黑色素瘤）：指导药物
11、治疗、判断预后9. CCND1/CEN11、MDM2/CEN12（间质瘤）：判断预后10.SYT(滑膜肉瘤)：辅助诊断11.EWS(尤文肉瘤)：辅助诊断12.FKHR(横纹肌肉瘤)：辅助诊断13.MDM2 (脂肪肉瘤)：辅助诊断,返回,返回,返回,返回,返回,返回,返回,返回,返回,返回,血液病FISH应用,目前常见的淋巴瘤染色体易位检测,IGH/BCL6 t(3;14)t(3;22) t（2；3）染色体易位-弥漫性大B细胞淋巴瘤IGH/BCL2 t(14;18)(q32;q21) 染色体易位-滤泡性淋巴瘤IGH/MYC t(8;14)(q24;q32) 染色体易位-Burkitts淋巴瘤IGH/CCND1 t(11;14)(q13;q32) 染色体易位-套细胞淋巴瘤API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21) 染色体易位-粘膜相关淋巴瘤IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) 染色体易位-粘膜相关淋巴瘤BCR/ABL t(9;22)染色体易位-慢性粒细胞性白血病PML/RAR t(15；17)(q22;q21)染色体易位-急性早幼粒细胞性白血病,返回,返回,返回,返回,返回,返回,返回,产前诊断FISH应用,谢谢！,
