1、1补心软脉颗粒提取纯化工艺的研究范玲 1，李爽 1，马兴苗 1，钱玉良 2，刘志辉 2，严冬 1*（ 1 南京中医药大学，南京 210046； 2江苏省中医院，南京 210036）摘要: 目的 优选补心软脉颗粒提取纯化工艺。 方法 采用正交试验法，以红景天中红景天苷的转移率和浸膏得率作为考察指标进行复方中红景天等五味饮片的水提取工艺的研究，并进行优选和验证。采用单因素试验法，以银杏叶中总黄酮醇苷的转移率作为考察指标进行银杏叶饮片的醇提工艺研究，并进行优选和验证。采用单因素试验法，以红景天中红景天苷的转移率和除杂率作为考察指标进行水提液醇沉工艺的研究，并进行优选和验证。结果：优选的水提工艺为：红
2、景天等五味饮片按处方比例加 8 倍量的水，提取 3 次，每次 0.5 h；优选的醇提工艺为：银杏叶饮片加 10 倍量 70%的醇，提取 2 次，每次 1h。优选的醇沉工艺为：水提液浓缩至相对密度 1.101.15，缓缓加入 95%乙醇至含醇量 70%，边加边搅拌，冷处静置 24h。结论 该工艺简便易行。关键词: 补心软脉颗粒；正交试验； 单因素试验；红景天；银杏叶Study on Process of Extraction of Buxinruanmai GranulesFAN Ling 1, LIU Zhi-hui2*(1.Nanjing University of Chinese Medi
3、cine, Nanjing 210046; 2.hospital of TCM of Jiangsu province, Nanjing, 210036)ABSTRACT: Aim To optimize the technique of extraction of Buxinruanmai Granules. Methods The orthogonal design and Singer factor test was respectively used to optimize and validate water-extracting process with the indices o
4、f the transferring rate of salidroside from Rhodioda crenulata and the rate of dried extract and ethanol-precipiting process with the indices of the transferring rate of salidroside from Rhodioda crenulata and imputity rate. Singer factor test was used to optimize and validate ethanol- extracting pr
5、ocess with the indices of the transferring rate of total flavonol glycosides . Results The optimal conditions of water extraction was to decocte 3 times with 8 times water, 0.5 hour for each time and of ethanol extraction was to decocte 2 times with 基金项目：江苏省科技支撑计划-社会发展项目（BE2011816）1作者简介 范玲（1986-）女 南
6、京中医药大学 10 级药剂学硕士研究生，Tel ：13770596786 Email：fll861031 *通讯作者：严冬，硕士生导师，主要从事中医临床及中药新药开发研究。Tel：025-86529291 ，E-mail：y12d12 12 times 70% ethanol, 1 hour for each time .The most optimal alcohol precipitation conditions were as follows: concentrate water extract until its density is 1.101.15, add alcohol un
7、til concentration of ethanol becomes 70%，precipitated 24 h. Conclusion The technology was simple.KEY WORDS: Buxinruanmai Granules; Orthogonal design; Singer factor test; Rhodioda crenulata; Folium Ginkgo补心软脉颗粒来源于江苏省中医院临床经验方，由红景天、麦冬、山萸肉等六味中药组成，具有补益心肾，化瘀通络之功效，临床上用于治疗冠心病气阴两虚夹有瘀血者。方中红景天为君药，其主要有效成分为红景天苷
8、1。本研究 以红景天苷转移率、浸膏得率和除杂率为指标，采用正交试验方法和单因素试验方法，分别研究了红景天、麦冬、山茱萸、虎杖、水蛭五味饮片的水提工艺和醇沉工艺条件，并进行了优选和验证；采用单因素试验方法，以总黄酮醇苷转移率为指标，研究了银杏叶的醇提工艺条件，并进行优选和验证。1 材料1.1 仪器与设备 Agilent1100 高效液相色谱仪(G1311A 四元泵，自动进样器，VWD 检测器，安捷伦高效液相化学工作站)；BP-211D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司） ；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司） ；101-1A 型数显电热鼓风干燥箱（上海沪南科学仪器联营厂） 。1.2 试药
9、红景天等饮片均购于安徽协和成药业饮片有限公司，经检验均符合 2010 版中华人民共和国药典 （一部）项下相关要求和规定；槲皮素（购自中国药品生物制品检定所，批号：0081-9304，含量测定用） 、山奈素、异鼠李素、红景天苷（均购自四川省维克奇生物科技有限公司、批号分别为：100812、110724、100826，含量测定用） ；HPLC 测定用甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。2 方法和结果2.1 水提工艺优选2.1.1 样品测定2.1.1.1 浸膏得率的测定 精密吸取“2.1.2.2”项下水提取液 10ml，置于蒸发皿中，水浴蒸干，105干燥 3h，置干燥器中冷却 30min，迅
10、速称重(W)，按下式计算浸膏得率。浸膏得率=WV/(M10) 100%(W 一浸膏重量，V 一样品液体积，M 一饮片重量)2.1.1.2 红景天苷含量测定2.1.1.2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱： Hedera-ODS-2 C18柱(250 mm 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇（A）-水：15:85 。流速：1 mL/min；柱温：30 ；检测波长：275 nm。2.1.1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取红景天苷对照品 9.07mg，置于 25 mL 的容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得(红景天苷含量 362.8g/mL)。2.1.1.2.3 标准曲线绘制 取上述红景天
11、苷对照品贮备液，分别加甲醇稀释成 362.80， 181.40， 145.12， 72.56， 36.28g/mL 的对照品溶液， 精密吸取上述对照品溶液 10L 进样，测定峰面积值，以红景天苷的进样量(X，g)对其峰面积值（ Y）进行线性回归，回归方程为：Y=2.7772X +5.2237，r=1 ，结果表明：在 0. 36283.6280g 范围内，峰面积值与红景天苷进样量有良好的线性关系。2.1.1.2.4 供试品溶液的制备 精密吸取已定容的水提取液 5 mL 置 25 mL 的容量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 m 滤膜滤过，取续滤液即得。2.1.1.2.5 含量测定 分别精密吸取对照
12、品溶液和供试品溶液各 10 L，注入液相色谱仪，测定水提液中红景天苷的含量，计算其转移率。（转移率=供试品溶液中红景天苷的含量/红景天饮片中红景天苷含量100%）结果见表 2。2.1.2 红景天等饮片提取工艺条件的考察2.1.2.1 试验设计 采用 L9(34)正交试验法，选定加水量（A ） 、提取时间(B)、提取次数 (C)为考察因素，每个因素各设 3 个水平，所选因素水平及正交试验方案见表 1 表 2。表 1 水提工艺因素水平表水平 A(加水量） /倍 B（提取时间）/h C（提取次数）/次1 8 0.5 12 10 1 23 12 1.5 32.1.2.2 试验方法与结果 按处方比例称取
13、红景天等五味饮片，根据表 2 的安排进行提取，滤过，滤液加水稀释至 500ml，摇匀，备用。取水提液适量，分别测定红景天苷含量及浸膏得率。结果见表 2。表 2 正交试验数据及极差分析结果水平 A B C D提取率（% ）转移率（% ）浸膏得率（% ）综合评分1 1 1 1 1 0.55 48.84 16.53 69.522 1 2 2 2 0.73 64.37 32.46 75.883 1 3 3 3 1.04 92.39 43.65 91.864 2 1 2 3 0.82 72.36 29.43 82.115 2 2 3 1 1.02 90.19 42.44 90.696 2 3 1 2 0
14、.80 70.36 28.68 80.937 3 1 3 2 1.00 88.28 37.95 90.708 3 2 1 3 0.68 60.17 25.10 74.889 3 3 2 1 0.85 74.87 39.29 80.91K1 237.26 242.33 225.33 241.12 K2 253.73 241.45 238.90 247.51K3 246.49 253.70 273.25 248.85R 5.49 4.08 15.97 2.58 注：F 0.05(2，2)=19，F 0.01(2，2)=99表 3 方差分析表方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值A 45
15、.43 2 22.72 3.99 0.05B 31.12 2 15.56 2.74 0.05C 406.71 2 203.36 35.75 0.05误差 11.38 2 5.69 2.1.2.3 结果分析 采用综合评分法对实验结果进行方差分析，即综合评分 = 浸膏得率评分 + 转移率评分。其中，浸膏得率评分 = 权重系数(0. 3) (100 + 最小浸膏得率 浸膏得率)；转移率评分 = 权重系数(0. 7) (100 最大红景天苷转移率 + 红景天苷转移率)。对表 2 中试验结果进行数据处理，并进行直观分析和方差分析(见表 2、3) 。由直观分析（表 2）可知，三因素的主次顺序为 C 、A
16、、B，最佳提取工艺条件为 A2B3C3；由方差分析（表 3）可以看出，B 因素对红景天苷转移率有显著性影响(P0.05)，A 、C 因素对红景天苷转移率无显著性影响(P 0.05)，从节能、节时的角度考虑，优选水提取工艺为A1B1C3，即 8 倍量的水提取 3 次，每次 0.5 h。2.1.2.4 验证试验 按处方比例称取红景天等饮片 3 份 ，按水提正交试验所优选的工艺条件进行 3 次重复试验，测定提取液中红景天苷转移率（%）分别为：88.02、84.23、87.86，RSD=2.47%；浸膏得率（% ）分别为：37.98、36.67、38.29，RSD=2.28%。结果表明优选出的工艺稳定
17、性良好。2.2 银杏叶醇提工艺优选2.2.1 总黄酮醇苷含量测定2.2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱： Hedera-ODS-2 C18柱(250 mm 4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇（A）-0.4%磷酸水：50:50 。流速：1 mL/min；柱温：30 ；检测波长：360nm。2.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品槲皮素 5.64mg，山奈素 6.85 mg，异鼠李素3.27 mg 置于 50 mL 的容量瓶中，甲醇定容，即得混标母液（槲皮素母液含量 112.8g/ mL、山奈素母液含量 137.0g/ mL、异鼠李素母液含量 65.4g/ mL） 。分别精密
18、吸取2ml、3ml、4ml、5ml 混标母液于 10ml 的容量瓶中，甲醇定容，即得一系列浓度的混标稀释液。2.2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取上述混标液 5ul，以测得的峰面积为纵坐标，槲皮素、山奈素、异鼠李素进样量为横坐标，绘制标准曲线，得槲皮素回归方程：Y=3737.5X+10.542(r=0.9994) ，结果表明在 0.08450.5636g 范围内，峰面积值与槲皮素进样量有良好的线性关系；山奈素回归方程：Y=4153.7X-8.8859(r=0.9996) 结果表明在0.10270.6848g 范围内，峰面积值与 山奈素进样量有良好的线性关系 ；异鼠李素回归方程：Y=3375.
19、1X+4.6123(r=0.9994)，结果表明在 0.04910.3270g 范围内，峰面积值与异鼠李素进样量有良好的线性关系。2.2.1.4 供试品溶液的制备 精密吸取 25mL 醇提液，加入 5ml25%HCl 水解 60min，水解液冷却后，甲醇定容至 50mL，摇匀，0.45 m 滤膜滤过，取续滤液即得。2.2.1.5 含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 5 L，注入液相色谱仪，测定醇提液中总黄酮醇苷的含量，计算其转移率。2.2.2 银杏叶饮片提取工艺条件的考察2.2.2.1 粉碎度考察 分别取银杏叶饮片、粗粉、细粉 10g，用 10 倍量 95%乙醇回流提取2 次，每次
20、 1h，合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为 55.89%、57.45% 、58.89%，结果显示：饮片粉碎度对总黄酮醇苷的转移率影响不大，所以选择银杏叶饮片提取。2.2.2.2 乙醇浓度的考察 取银杏叶 10g，分别用 10 倍量 0%、30%、50%、70% 、95% 乙醇回流提取 2 次，每次 1h，合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为 50.45%、67.80% 、 78. 46%、88.45%、53.71% ，结果显示：总黄酮醇苷的转移率随乙醇浓度增加，先增加后减少，当乙醇浓度达 70%，
21、转移率达到最大。所以选择 70%乙醇。2.2.2.3 加醇倍量的考察 取银杏叶 10g，分别用 8 倍、10 倍、12 倍、15 倍、20 倍 70%乙醇回流提取 2 次，每次 1h，合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为 80.54%、87.10% 、88.79%、89.01%、89.86% 。结果显示：总黄酮醇苷的转移率随乙醇倍量增加而增加，但当乙醇倍量为 10 倍时，乙醇倍量再增加，转移率变化不大。所以从节能角度考虑，选择 10 倍乙醇量。2.2.2.4 提取时间的考察 取银杏叶 10g，分别用 10 倍 70%乙醇回流提取 2 次，每次0.
22、5h、1h、1.5h，2h 合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为 70.10%、89.34% 、90.65%、90.97%。结果显示：总黄酮醇苷的转移率随提取时间增加而增加，但当每次提取时间为 1 小时，再增加提取时间，总黄酮醇苷的转移率变化不大，所以从节能节时角度考虑，选择每次提取 1 小时。2.2.2.5 提取次数的考察 取银杏叶 10g，分别用 10 倍 70%乙醇回流提取 3 次，每次 1h，提取液分别收集，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为 50.81%、37.36%、5.98%。结果显示：总黄酮醇
23、苷的转移率随提取次数增加而增加，但当提取次数为 2 次，再增加提取次数，总黄酮醇苷的转移率变化不大，所以从节能节时角度考虑，选择提取 2 次。2.2.2.6 验证试验 取银杏叶 10g，分别用 10 倍 70%乙醇回流提取 2 次，每次 1h，合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定总黄酮醇苷的含量。总黄酮醇苷的转移率分别为89.52%、88.76%、85.69% ，RSD=2.30% 。结果表明优选出的工艺稳定性良好 。2.3 水提液醇沉工艺优选2.3.1 样品测定2.3.1.1 浸膏得率的测定 同 2.1.1.1 ，除杂率=醇沉前药液浸膏得率醇沉后药液浸膏得率。2.3.1.2 红景天苷含
24、量测定2.3.1.2.1 色谱条件与系统适应性试验 、标准曲线绘制、对照品溶液的制备分别同2.1.1.2.1、2.1.1.2.2、2.1.1.2.32.3.1.2.4 供试品溶液的制备 精密量取一定体积的醇沉液，水浴挥去乙醇，残渣加甲醇溶解并定容至 5mL，微孔滤膜滤过，即得。2.3.1.2.5 含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10 L，注入液相色谱仪，测定醇提液中红景天苷的含量，计算其转移率。红景天苷转移率=醇沉液中红景天苷含量/水提液中红景天苷含量100%。2.3.2 水提液醇沉条件的考察2.3.2.1 醇沉浓度的考察 取水提液适量，浓缩至相对密度为 1.10 左右的浸膏，
25、分别加入95%乙醇至含醇量为 50%、60%、70% 、80%，冷处静置 24h，滤过。按含量测定方法制备供试品，测定红景天苷含量，并计算转移率。结果见表 4表 4 乙醇浓度对红景天苷转移率和除杂率的影响含醇量(%)红景天苷转移率（% ）干浸膏得率（% ）除杂率（%）50 70.51 30.5 7.1560 81.26 29.58 8.0770 88.94 23.63 14.0280 85.34 19.24 18.41由表可知，随着醇沉浓度增加，除杂率逐渐增高，含醇量达 70%时，红景天苷的转移率最高，除杂率亦较高，故醇沉至含醇量 70%即可。 2.3.2.2 浸膏相对密度的考察 精密量取一定
26、体积的水提液，分别浓缩至相对密度1.08，1.14，1.19，缓缓加入 95%乙醇，边加边搅拌至含醇量 70%，冷处静置 24h，滤过。按含量测定方法制备供试品，测定红景天苷含量，并计算转移率。结果见表 5。表 5 浸膏相对密度对红景天苷转移率和除杂率的影响相对密度红景天苷转移率（% ）干浸膏得率（% ）除杂率（%）1.08 90.06 32.7 4.951.14 85.36 23.98 13.671.19 83.74 22.27 15.38由表可知，随着浸膏相对密度增大，红景天苷转移率依次降低，除杂率逐渐升高。结合实际生产条件和成本，浸膏浓缩至相对密度为 1.101.15 即可，有效成分转移
27、率较高，除杂率达到要求。2.3.3 验证试验 将水提液浓缩至相对密度 1.101.15，缓缓加入 95%乙醇至含醇量 70%，边加边搅拌，冷处静置 24h。按含量测定方法制备供试品，测定红景天苷含量。红景天苷的转移率分别为：87.35%、85.98%、83.73%，RSD=2.13%，除杂率分别为：13.85%、13.09%、13.53% ，RSD=2.83% 。结果表明优选出的工艺稳定性良好 。3 讨论3.1 方中红景天主要有效成分是红景天苷，它对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用；麦冬的主要有效成分是麦冬多糖和麦冬皂苷，具有抗心肌缺血和心肌梗死作用；山茱萸主要有效成分是山茱萸总苷，是强心的
28、有效成分；水蛭的主要有效成分是水蛭素，具有抗凝血作用；虎杖的主要有效成分是虎杖苷，对动物的冠状动脉、肺动脉和脑血管等都有扩张作用。以上各种成分的水溶性均很好。所以红景天等五味饮片合为水提。3.2 红景天等五味饮片水提试验表明：提取次数对红景天苷的转移率有显著性影响。在优选水提工艺中其它参数不变的情况下，提取 3 次和 4 次的红景天苷转移率（%）分别为86.70、88.51，结果差异也不大，所以从生产成本考虑，将水提的提取次数定为 3 次。3.3 综合评分=(100 最大红景天苷转移率 + 红景天苷转移率)0.7+(100 + 最小浸膏得率 浸膏得率) 0.3。红景天具有增强心肌收缩力，加速心
29、肌的收缩速度，降低平均动脉压的作用 3。红景天苷是红景天的有效成分之一，具有对异丙基肾上腺素引起的大鼠心肌缺血具有显著的保护作用，减轻心肌细胞的损伤，改善心脏功能 4。与补心软脉的主治功能一致。浸膏得率是评价水提取效率的传统手段，兼顾上述两个关键指标，权重系数定位0.7、0.3，具有一定的合理性。3.4 从银杏叶中提取的黄酮类化合物能有效改善脑血管和末梢血管循环，长期服用几乎无副作用，用于治疗动脉硬化等心血管疾病极为有效 5。与补心软脉的主治功能一致。黄酮类化合物主要由槲皮素、山柰素、异鼠李素及它们与各种糖形成的黄酮苷，因此分析测定黄酮苷含量时，一般先通过水解方法，使许多复杂的黄酮苷转化成简单
30、的槲皮素、山柰素、异鼠李素 3 种黄酮苷元 6。3.5 中药醇沉的影响因素主要有含醇量、浸膏密度、乙醇用量和所用乙醇浓度、以及药液温度、加醇方式、室内温度、醇沉时间等 7。实际生产中含醇量和浸膏密度对醇沉效果影响较大，故选择二者作为水提液醇沉工艺的工艺参数，采用单因素试验法优选出的工艺有效成分转移率和除杂率均较高。 3.6 在加入乙醇时要注意快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失；沉淀用乙醇(与药液中的乙醇体积分数相同) 洗涤，可减少有效成分在沉淀中的包裹损失；沉淀液要密闭冷藏，可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作；醇沉时要等待浓缩的药液冷却后方可加
31、入乙醇，以免乙醇受热挥发损失 8参考文献1 刘孟华，李沛波，苏薇薇红景天化学成分及其药理作用研究进展J 中南药学，2006，4（6）：463-4662 陈小明，徐超群.红景天中红景天苷提取工艺的研究J.华西药学杂志，2010,25（3）：329-331.3 Mo SR， Lu B， Liang FEffct of Rhodiola sacra SH Fu on hear， hemodynamics and myocardial contractility J Chinese Journal 0f Clinical Rehabilitation，2005， 9 (1) ：204-2064 姜敏辉，吴翔，曹卫军红景天对心肌缺血损伤保护作用的实验研及临床应用 J 江苏医药， 2005，31( 5 ) ：369-3705 钱之玉，傅 建，胡 梅.银杏黄酮的 HPLC 检测及其探讨J .中国药科大学学报,1996,27(4):253.6 杜安全,王先荣, 周正华.银杏叶总黄酮苷的 HPLC 法分析水解条件.安徽医药，2001，5（3）：164-165.7肖 琼，沈平孃.中药醇沉工艺的关键影响因素J .中成药， 2005，27（2）：143-144.8 侯林中，张熙洁 . 正交试验优选宽心口服液醇沉工艺J .中国实验方剂学，2011，17（2）：32-33.
