1、血流感染实验室诊断方法新进展,Page 2,主要内容,Page 3,血流感染,血败血症（septicemia）:病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等 菌血症(bacteremia）:细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。 脓毒血症（sepsis）:感染+全身性炎症反应，血培养可以阳性或阴性血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。,泛指是指病原菌及其毒素侵入血流所引起的一类临床综合征。病程 中常有炎症介质的激活和释放，引起高热、寒战
2、、心动过速 呼吸急促、皮疹和神志改变等一系列临床症状，严重者可引 起休克、DIC和多器官功能衰竭，死亡率较高。,Page 4,医院获得性血流感染原发性血流感染：实验室证实血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI）,标准：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。 临床血流感染（Clinical Sepsis）标准：具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： 1.未
3、做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者2.其它部位无明显感染者3.医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗,Page 5,血培养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。社区获得性血流感染,继发性血流感染,Page 6,血流感染监测的重要性,为血流感染的流行病学提供基本信息，监测发生趋势和发生率为新出现的病原菌或耐药表型提供早期预警；监测罕见菌的检测为公共卫生决策者进一步调查提供帮助。为临床医生提供反馈信息,紧急！,Page 7,血流感染监测历史,Page 8,血流感染流行病学特点,革兰氏阳性菌感染呈上升趋势,特别是凝固酶阴
4、性葡萄球菌、肠球菌真菌血流感染发病率逐年上升革兰阴性菌感染下降耐药菌比例逐年增加广谱耐药菌株（VRE、MRSA/MRSE 、VISA/VRSA 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异院内BSI患者病死率高,Page 9,肿瘤患者血流感染流行病学趋势,Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2013) 32:841850,Page 10,Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2013) 32:841850,Page 11,革兰氏阴性菌是肿瘤患者常见分离菌，这也是近年来血流感染流行病学趋势，由革兰阳性菌向革兰阴性菌转变。（1）主要原因减少或停
5、止应用预防性抗生素（2）化疗特性（清髓性或非清髓性化疗），应用低毒性药物 (3) 肿瘤患者管理方式改变（减少使用留置导管）（4）环境条件如气候类型（铜绿假单胞菌常在温带地区分离）另一趋势是多重耐药革兰阴性菌同革兰阳性菌一样在世界各地广泛出现，耐药菌的增长同抗菌药物发展密切相关 (1) 喹诺酮类耐药菌约2/3是E.coli（2)产 ESBLs菌血流感染在世界各地呈增长趋势（3）VRE感染菌呈增长趋势，特别是在美国（4）MDR革兰阴性菌与发病率、死亡率及医疗费用增长密切相关,肿瘤患者血流感染流行病学原因分析,Page 12,血流感染诊治实验室方法,传统方法：血培养 相关生物标记物检测：CRP、PC
6、T、sTREM-1 和presepsin分子诊断技术:PCR、Fish等,Page 13,血培养三级报告制度,血培养阳性,终报告,革兰染色,传种培养,初步报告 (直接药敏),鉴定菌株,电话报告,鉴定标准药敏,Page 14,CRP与疾病的活动性及检测的临床意义,Page 15,C反应蛋白，CRP,常用感染指标的比较：细菌或病毒感染鉴别的特异性、灵敏性：CRPWBCESR,Page 16,CRP对抗生素指导使用,.鉴别诊断病毒或细菌感染的早期、首选指标阴性预测值高，所以10mg/L，比升高更有意义，如果是感染，基本排除细菌感染的可能，不用抗生素治疗有效监控抗生素的疗效及时确定抗生素的疗程及早发现
7、创伤、术后并发感染术前CRP升高者，术后感染发生率远高于术前CRP不高者,主要缺点成人败血症患者中的特异度很低，但通常用于新生儿早期发病败血症的筛选,Page 17,PCT对脓毒症的诊断：,临床指征: 不特异SIRS标准：发热、WBC计数、心跳过速、呼吸频率等微生物学:血培养(时间：最少2-3天；操作要求高：一定的温度、湿度、营养要求高、采血量大、消毒等等；灵敏度和特异性)分子生物学检测(成本较高，人为影响因素较多),培 养,鉴定及药敏,报 告,微生物感染诊断流程,Page 18,培 养,鉴定及药敏,报 告,高特异性生物标记物对脓毒症的快速诊断,降钙素原- 高特异性，指南推荐脓毒血症早期诊断指
8、标,CRP-低特异性，仅仅作为炎性反应标志物，易受类固醇药物影响,PCT,Page 19,在感染疾病严重程度的发展过程中，PCT随着严重程度的不同（局部感染、脓毒血症、严重脓毒血症、脓毒性休克），呈现由低到高的浓度变化,血PCT浓度与病程发展呈正相关可对感染程度及器官机能障碍的严重性进行准确的判断,PCT对细菌感染严重程度判断,Page 20,PCT指导抗生素使用,局限性：对于不同情况感染的抗生素使用的指导意义还不能确定，而其敏感度偏低，作为临床检测手段还有一定的局限性。非败血症的患者以及一些有全身炎症反应综合征（例如外伤、手术）的情况时， 都有可能会一过性的上升，而在一些败血症的患者中， 也
9、有不升高的情况出现,Page 21,与血流感染相关的新的生物标志物,可溶性尿激酶溶酶原激活受体（suPAR） 预后评估肾上腺髓质素前体（ pro-ADM）可溶性髓系细胞触发受体-(sTREM-1） 诊断和预后评估可溶性白细胞分化抗原 亚型(presepsin) 这些标记物都是由于病原菌感染导致其表达的上调而和败血症关联起来。 presepsin在早期诊断败血症以及预后评估方面是比较有价值的指标，它的敏感度为71 72，特异度为70 86,，,Page 22,当被注入样本的培养瓶中有微生物存在时，微生物在代谢过程中产生CO2，CO2与培养瓶瓶底荧光质发生反应，仪器的光电探测系统测量荧光强度的水平
10、。荧光信号变化与CO2变化成正比，计算机系统对检测到的原始数据采用一定的算法来判断被检测样本是否有微生物的存在,并可根据运算结果提供生长曲线来做出相应的判断和分析报告。,血培养仪基本原理：,提示,Page 23,阳性报警时间（Time to positivity ，TTP）即样品从开始培养到阳性警报出现的时间。它是近年来研究的一种可预测血流感染程度快速有效的替代标记物.,血培养阳性报警时间,当培养至24 h后血培养仍为阴性，建议可缩窄抗菌谱而主要针对革兰阳性菌进行选择用药；当培养至48h后血培养仍为阴性而临床感染症状明显，可高度怀疑为念珠菌性血流感染；若当培养72 h后仍为阴性而患者临床表现良
11、好可停止应用抗菌药物,Page 24,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测：PCR扩增特定靶位多态性分析测序后续基因检测种特异性real-time PCR,Page 25,血培养阳性核酸荧光原位杂交（PNA FISH）,血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH,革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌报道Salmonella spp.90min PNA FISH完成,Page 26,MALDI-TOF MS,
12、基质辅助激光解析电离（MALDI）原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质,Page 27,分子生物检测血标本,几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏感性，但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来不可替代血培养！相较于血培养，其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗，或改变治疗方案污染导致的假阳性无法排除！评估血培养阴性
13、的PCR阳性结果分析其它微生物检查结果（如BALF，伤口拭子等）免疫反应指标,Page 28,BSI发病率逐年升高，尤其是革兰阳性菌和真菌BSI病原菌耐药率持续升高优化血培养流程，提高阳性率，降低污染率结合临床分析血培养结果分子生物学技术快速诊断BSI，MALDI-TOF MS、商品化多重PCR检测平台、PNA-FISH成为未来发展方向血培养仍不可取代！,结束语,坚持把简单的事情做好就是不简单 坚持把平凡的事情做好就是不平凡,Page 29,结束语,传统诊断血流感染的标准方法是拔除可疑引起感染的导管或更换导管后做导管尖端的培养，仅15%20%病人拔除导管后确诊为导管相关性血流感染。目前实验室发展的几种保留导管的诊断方法各有局限性，无需拔除导管即可确诊的方法亟待进一步发展。,坚持把简单的事情做好就是不简单 坚持把平凡的事情做好就是不平凡,谢谢聆听！,
