1、基因工程期末试题 复习要点整理 基因工程是 70 年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组 DNA 基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。 扬州大学试题纸 一、名词解释 ：共 10 题，每题 2 分，共 20分。 1. 基因 : 是 DNA 分子
2、中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆 : 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因 : 是指应用 DNA 体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子 : 导入外源 DNA 后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端 DNA 短序列。 6. RT-PCR: 是指以 mRNA 在反转录酶作用下合成 cDNA 第一链为模板进行的 PCR。 7. ORF : 起始于 AUG
3、、止于 UAA、 UGA、 UAG 的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的 DNA 片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体 DNA 可与外源 DNA 的同源性DNA 序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5RACE: 是一种通过 PCR 进行 cDNA 末端快速克隆的技术 ，是以 mRNA 为模板反转录成 cDNA 第一链后用 PCR 技术扩增出某个特异位点到 5 端之间未知序列的方法。 四、简答题：共 4 题，共 20分。 1简述获得目的基因常
4、用的几种方法。（ 5分） 答： （ 1）直接从染色体 DNA 中分离：（ 1 分） 仅适用于原核生物、叶绿体和线粒体基因的分离，较少采用。 （ 2）人工合成：（ 1分） 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 （ 3）从 mRNA 合成 cDNA：（ 1 分） 采用一定的方法钓取特定基因的 mRNA，再通过逆转录酶催化 合成其互补 DNA（ cDNA），除去 RNA 链后，再用 DNA 聚合酶合成其互补 DNA 链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 （ 4）利用 PCR 合成：（ 1分） 如已知目的基因两端
5、的序列，则可采用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)技术，在体外合成目的基因。 （ 5）从基因文库中筛选：（ 1 分） 首先建立基因组或 cDNA 文库，利用探针从文库中筛选目的克隆。 2. 分子克隆载体应具备哪些特点？（ 4分） 答： (1) 在宿主细胞内必须能够自主复制（ 1分） (2) 必须 具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制（ 1 分） (3) 有一定的选择标记，用于筛选（ 1 分） (4) 具有较高的拷贝数，便于载体的制备（ 1 分） 3. cDNA 文库和基因组文库的主要差别有哪些？（ 5分） 答： （ 1）基因组
6、文库克隆的是任何基因，包括未知功能的 DNA 序列； cDNA 文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。（ 2分） （ 2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响； cDNA 文库克隆的是不完全的编码 DNA 序列，因它受发育和调控因子的影响。（ 1分） （ 3）基因组文库中的编 码基因是真实基因，含有内含子和外显子，而 cDNA 文库克隆的是不含内含子的功能基因。（ 2 分） 4. 某一质粒载体具有 Tetr 和 Kanr 的表型，在 Kan 抗性基因内有一 Bgl I 的切点。现用 Bgl I 切割该载体进行基因克隆，问： (1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素 ? (2)
7、培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型 ? (3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体 ? （ 6分） 答： (1)加四环素； (2)TetrKans 和 TetrKanr； (3)重新点种在含 Tet、 Kan 和只加 Tet的 平板上，选择只在 Tet 平板上 生长的菌落，即为所需的重组体。 五分析题 10 分 科学家将人的生长素基因与大肠杆菌的 DNA 分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。过程如右图所示，据图回答： (1)人的基因之所以能与大肠杆菌的 DNA 分子进行重组，原因是什么？ (2)过程 表示的是采取什么的方法来获取目的基因？ (3)检测大肠杆菌 B 是否导入了质
8、粒 或重组质粒，可采用的方法和理由？ (4)如果把已经导入了普通质粒 A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，发生什么现象？分析原因？ 答 :（ 1）人的基因与大肠杆菌 DNA 的组成成分相同，结构相同 (2 分 ) (2) 反转录法 (逆转录法 ) (2 分 ) (3)将得到的大肠杆菌 B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒 A或重组质粒，反之则没有导入。 因为普通质粒 A和重组质粒上都有抗氨苄青霉素基因 (2 分 ) (4)有的能生长，有的不能生长 导入普通质粒 A的细菌能生长，因为普通质粒 A上有四环素抗性基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目
9、的基因正插在四环素抗性基因中，破坏了其结构和功能。 (4 分 ) 六、论述题：共 1 题， 15 分。 1在基因工程操作过程中，使用的克隆载体 需要具备哪些条件？选择受体细胞时需要具备哪些基本原则？ 答：克隆载体需要具备条件：（ 7 分） 载体都能携带外源 DNA 片段 (基因 )进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体 DNA 上，随着染色体 DNA 的复制而同步复制。 (1 分 ) 载体都具有合适的筛选遗传标记。 (1 分 ) 载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。 (1 分 ) 载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体
10、细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 (1 分 ) 载体本身的分子量都比较小，可容纳较 大的外源基因片段。 (1 分 ) 载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 (1 分 ) 载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 (0.5 分 ) 载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 (0.5 分 ) 受体细胞的选择应具备的基本原则：（ 8分） 便于重组 DNA 分子的导入。 (1分 ) 便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。 (1分 ) 遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而
11、不影响外源基因的表达效率。对动 物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。 (1 分 ) 受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。 (1 分 ) 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。 (1 分 ) 能使重组 DNA 分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组 DNA 分子的降解破坏作用。 (1 分 )
12、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。 (1 分 ) 具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。 (0.5 分 ) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 (0.5 分 ) 基因工程原理复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（ DNA 的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组 DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征： 1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、 强调了确定的 DNA 片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程
13、的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、 DNA 的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组 DNA 分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认 识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养
14、成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转 基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有 10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才
15、能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章 DNA 的分子特性与利用 1、 原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控 原核基因表达调控主要是在 转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： l 1基因组 DNA 存在的形式与原核生物不同； l 2真核生物中转录和翻译分开进行； l 3基因表达具有细胞特异性或组织特异性； l 4真核基因表达的调控在多个水平上进行： DNA 水平的调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、 什么是基因？根据基因的产
16、物，基因可分为哪三类？ 基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。 根据基因的产物，基因可分为三类： l 转录并翻译编码蛋白 质的基因 : 包括结构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因 l 转录但不翻译产物的基因 : 包括 tRNA、 rRNA l 不转录但有功能的 DNA 区段 : 如启动子、操纵基因 3、 引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？ 引起核酸变性的因素： -温度、酸、碱、甲醛和尿素等。 DNA 变性后，它的一系列性质发生变化，如紫外吸收 (260 nm)值升高（增色效应） , 粘度降低等，如 DNA 增加 25 40%.
17、RNA 约增加 1.1%。 4、 DNA 复性及其影响因素。 变性 DNA 在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重 新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。 DNA 复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结构有关：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。 （附加：注意：将热变性的 DNA 骤然冷却至低温时， DNA 不可能复性。但是将变性的 DNA 缓慢冷却时，可以复性。 复性的应用：核酸的杂交，分子扩增） 第二章 基因工程操作的基本技术 1. DNA 凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正
18、极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分 离不同大小核酸分子的目的。 2. DNA 凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？ 1）分子本身的影响 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快 分子构型：超螺旋 解螺旋 2）电场：直流电场 电压高则快 电压太高则结果不准确 常用 35V/CM 3）支持物介质 种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶浓度 : 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳 4）电泳缓冲液 pH 值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 _ 电流大 _发热快 _胶溶解 种类： TAE、 TBE、 TPE、 TNE 3. PCR 的原理和主要反应过程，
19、并分析影响 PCR 扩增的影响因素。 PCR 原理：变性温度下， DNA 双链变性双螺旋解开成单链 DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链 DNA 特异结合，然后在 DNA 聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板 DNA 互补的新链，实现 DNA 的扩增。 影响 PCR 扩增的影响因素： (1)Taq 酶：常用 1U/25L 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性； (2)dNTP 的浓度：常 用 100-200mol/L，不能低于 20mol/L，特异性、保真性； (3) 模板：主要考虑纯度及使
20、用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个 ng 到 100ng. (4) 引物浓度： 0.1-0.5mol/L 之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； (5)Mg2 浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物 -模板退火、特异性 (6)PCR 反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度 Tm 与时间、引物延伸温度与时间和循环数 4. PCR 引物设计的原则，若给一指定 DNA 序列并需要通过 PCR 扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了） 引物设计原则： 1、 G C 含量 45-55%； 2、 Tm值高于 55；
21、3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体 5. 定量 PCR 的原理？ Ct值的含义。 原理：通过实时检测 PCR 每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。 初始模板量 X0 的对数值与 C(T) 值之间呈线性关系： log X0= - log(1 Ex) *Ct log N 6. 分子杂交的类型主要有哪些？探针 的标记方法与标记类型？常用的双链 DNA的标记方法是哪两种？ 探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法， PCR 标记法，体外转录标记法。 探针按核酸分子分： DNA 探针和 RNA 探针； 按标记物的不同：放射性标
22、记探针和非放射性标记探针。 标记类型：按核酸分子的不同：可分为 DNA 探针和 RNA 探针 根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针； 双链 DNA 探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法； 7. Southern 杂交一般过程及影响杂交因素。 Southern 杂交操作步骤 : (1) 用 限制性内切酶酶切 DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将 DNA 片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上； (3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源 DNA 片段特异性结合； (5) 洗脱：去除非特异性结合的探针； (6) 自显影检查目的 DNA 所在的位置。 Southern 杂交影响因子 1）、目的 DNA 在总 DNA 中所占的比例 2）、探针的大小和标记效率 3）、转移到滤膜上的 DNA 量 4）、探针与靶 DNA 的同源性 8. 基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？ 基因组文库的构建 过程： 1）从生物体提取大片断的基因组 DNA； 2）用适当的限制性内切酶（常为 4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组 DNA ； 3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的 DNA 片断（根据载体的要求）； 4）载体的酶切、回收； 5）将处理好的基因组 DNA 片断与载体连接； 6）将重组子导入宿主细胞
