1、谷子 ARF 基因家族的鉴定与生物信息学分析赵艳 1 翁巧云 1 马海莲 1 宋晋辉 1 袁进成 1 王凌云 1 董志平 2 刘颖慧 1*1 河北北方学院 河北张家口 0750002 河北省农林科学院谷子研究所 河北石家庄 050001摘要：生长素应答因子（auxin response factors，ARF）是一类可以结合在生长素应答基因启动子区域部位的转录因子，在植物的生长发育中起至关重要作用。本研究以谷子为材料，从谷子中鉴定出 24 个 ARF 基因并命名为 SiARFs。利用生物信息学对谷子 SiARFs 基因的结构、染色体分布、基因倍增模式、系统进化以及基因的表达模式进行分析。结果表
2、明，SiARF 基因家族在染色体上不均匀的分布，在除 2 号染色体外的其它染色体上都有该家族基因，基因的扩增模式为分散复制与片段复制。SiARFs 基因家族具有相对保守的结构，即包含一个保守的 B3 DNA 结构域，ARF 结构域和 Aux/IAA 结构域，ARF 蛋白的 3D 结构含有 3 个 螺旋和 7 个 折叠结构。进化树分析表明谷子 ARF 蛋白和物种相近的高粱、玉米聚在一起。大多数 ARF 基因在谷子根、茎、叶和穗中都有表达，不同基因表达量有较大差异可能和基因参与植物的多方面代谢过程密切相关。关键词：谷子；ARF；生物信息学分析；蛋白结构Genome-Wide Identificat
3、ion and Bioinformatics Analysis of ARF Gene Family in Setaria ItalicaAbstract: Auxin response factors (ARF) are important transcription factors that can regulate the expression of auxin genes and influence the plant growth. ARFs regulate the transcription of auxin-responsive genes through binding to
4、 their promoters. In this study, a total of 24 ARF genes are identified and analyzed and named SiARF. A comprehensive overview of the SiARFs is undertaken, including phylogenetic analysis, the gene structures analysis, chromosome locations, conserved motifs of proteins and gene expression pattern an
5、alysis.Twenty-four setaria italica ARF genes are distributed in all setaria italica chromosomes except chromosome. Setaria italica ARF proteins share one B3 DNA binding domain, which consists of threehelixes and sevensheets. And some of these proteins have an Aux/IAA domain and ARF domain. In additi
6、on, setaria italica ARF proteins are compared with the proteins in other species in order to discover the evolution of ARF genes. Our results also show that the expression of SiARF genes is diverse in different tissues. Keywords: setaria italica; ARF; information analysis; protein structure通讯作者：刘颖慧，
7、教授，研究方向为植物基因工程，email:资助项目：国家科技重大专项转“2014ZX0800909B”，十二五农村领域国家科技 计划项目“2011BAD06B01” ，河北北方学院重大项目“ZD201305”生长素（Auxin）是发现最早、研究最多、在植物体内普遍存在的植物激素。生长素在植物的顶端优势、微管的分化、胚胎的分化、根和茎的形态建成等植物的生长和发育各个阶段都起重要的作用。从分子水平上看，生长素在调节植物生长、发育过程需要一些生长素相关基因的表达和调控，这些基因包括 Aux/IAA 家族、GH3 家族和小的受生长素调控的RNA 家族（SAUR），以上的基因家族具有一个共性，即在它们的
8、启动子区都含有被称为生长素应答元件的顺式作用原件元件（TGTCTC ） 1，。生长素应答因子（auxin response factors，ARF ）就是一些可以结合顺式应答元件介导生长素信号反应的转录因子家族。作为生长素信号转导相关的主要蛋白组分之一，ARF 蛋白主要在植物生长的初期或早期发挥作用，它可与生长素应答原件元件（AuxRE）结合，发挥催化和刺激作用，ARF 也可与生长素结合，从而抑制与 AuxRE 的结合而发挥抑制作用 2。ARF 蛋白包括 3 个保守的结构域，在 N-端有植物特异的 B3 DNA-结合结构域 (DBD) ，通常 DBD 不能结合生长素应答基因，该结构域是植物特有
9、的而且保守性强；在中间具有激活结构域 (AD) 和抑制结构域（RD），如果 ARF 结合生长素应答原件元件就起到激活作用，如果结合生长素就起到抑制作用，中间的结构域决定 ARF 是发挥激活作用还是抑制作用，具有激活作用的结构域含有丰富的谷氨酰胺，抑制作用的结构域富含丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。在 C-端是保守的结构域（CTD），CTD 结构域负责 ARF 蛋白之间的同源聚集或者 ARF 蛋白和生长素应答基因的异源聚集，决定 ARF 的聚集状态 3。 谷子（setaria italica）在中国具有悠久的栽培历史，是中国北方的主要粮食之一。谷子基因组小且为二倍体，与水稻、高粱、玉米共线性高，
10、使其正成为禾本科基因组研究的模式植物之一，也成为研究 C4 植物的模式植物 4。目前谷子的全基因组测序已经完成，这为谷子分子生物学研究奠定了良好的基础 5。本研究利用生物信息学相关技术鉴定谷子的ARF 基因家族并对该家族基因结构进行分析，通过对其序列和蛋白的比较分析以期为谷子生长素相关基因的研究提供一定的参考。1.材料与方法1.1 谷子 ARF 基因的鉴定及序列分析首先从 Pfam 数据库（http:/pfam.xfam.org/ ）中下载 ARF 家族的隐马氏模型文件（Pfam 号码：PF06507） 6，从 Gramene（http:/www.gramene.org/）中通过 Pfam 号
11、码中找到与谷子相关的基因号码进行相似性搜索，找到与谷子相关的基因 ID 及相关蛋白序列，除去冗余，得到所需的无重复的基因、转录本及蛋白 ID、蛋白序列和外显子数量。然后使用 SMART（http:/smart.embl-heidelberg.de/）和CDD（ http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd /wrpsb.cgi）检测蛋白结构域 7,8。最后，使用 ProtParam（ http:/web.expasy.org/protparam/）找到与谷子 ARF 基因蛋白相关的其他信息，包括氨基酸数量、分子量以及等电点 9。1.2 染色体定位分析根据已经
12、得到的基因信息，从 Ensemble Plants 中查询谷子染色体的长度（http:/plants. ensembl.org/Setaria_italica/Info/Index），使用 adobe illustrator CS5 软件绘制染色体与基因位置。1.3 系统分析 ARF 蛋白与进化树的绘制使用在线 ProSite（http:/prosite.expasy.org/）分别分析 24 个 ARF 蛋白序列，得出每个蛋白相应的 B3 结合结构域， ARF 结构域和 AUX/IAA 结构域的位置 1110。利用 Clustal X在线分析所得到的 ARF 蛋白序列，下载得到分析结果 10
13、11。，然后使用 Sequence Format Converter（http:/genome.nci.nih.gov/tools/reformat.html）转换结构格式，最后使用MEGA6.0 软件用邻接法绘制进化树，bootstrap 设置为 100011。不同物种 ARF 蛋白进化树的绘制：采用玉米（39 个）、水稻（26 个）、二穗短柄草（24 个）、小立碗藓（14 个）、葡萄（20 个）、拟南芥（23 个）和谷子（24 个）的共170 个 ARF 蛋白进行综合分析，用上述方法绘制 ARF 蛋白的进化树。1.4 motifMotif 的获取和 ARF 蛋白的 3D 结构预测得到 AR
14、F 蛋白序列后，使用 MEME 工具（http:/ 的 motif 模式 12。使用 Weblogo（http:/ B3 DNA 结合结构域的 motif，得到的序列使用 SWISS-MODEL（http:/swissmodel.expasy.org/ workspace/index.php? func=modelling_simple1）预测其三维结构 13。用上述方法绘制水稻、二穗短柄草、高粱、葡萄、小立碗藓、苜蓿、黄豆、玉米和拟南芥的 B3 DNA 结合结构域3D 结构，与谷子进行对比分析 。1.5 谷子 ARF 基因的表达使用 GSCS2.0（http:/ ）分析 ARF 基因的编码序
15、列和完整序列 13，得到内含子-外显子结构。再使用MCSCAN（http:/chibba.agtec.uga.edu/duplication/mcscan/ ）推测这些基因的表达模式 14。在谷子转录因子数据库（http:/59.163.192.91/FmTFDb/）中分析谷子的 ARF 蛋白序列，得到ARF 基因在谷子的根、茎、叶、穗中的特异性表达情况 1514。2. 结果分析2.1 谷子 ARF 基因家族的鉴定从 Pfam 数据库中下载 ARF 家族的隐马氏模型文件（Pfam 号码：PF06507 ）为了搜集谷子的 ARF 基因 ，查找 ARF 蛋白 Pfam 号码用以查询相似序列，总结物
16、种基因蛋白保守序列，搜索谷子基因组数据库，共获得近 100 个 ARF 类似基因，使用 SMART 和 CDD 检测蛋白序列结构域，检查缺失并除去冗余，得到确定含有 ARF 结构域的基因，最终获得 24个谷子 ARF 基因序列，分别命名为 SiARF1SiARF24（表 1）。分析谷子 24 个 ARF 蛋白序列发现不同蛋白差异很大：编码 ARF 蛋白的氨基酸长度范围从 502 AA（SiARF5）到1133 AA（SiARF2），开放阅读框从 7774bp（SiARF6）到 2650bp（SiARF22），分子量范围从 54.44kDa（SiARF5 ）到 125.42kDa（SiARF2）
17、，等电点范围从 5.45（SiARF1 ）到9.14（SiARF8），蛋白含 2 个（SiARF4）到 16 个（SiARF6 ）内含子。从蛋白的基本特点可见 ARF 蛋白无论从序列的长度还是蛋白的特性变化都很大，表示该基因家族蛋白具有不同特性，同时执行不同的功能。值得注意的是大多数 ARF 蛋白的等电点都小于 7，表示多数 ARF 可能编码弱酸性的蛋白，在酸性的亚细胞环境中发挥作用。表 1 谷子 ARF 基因家族的鉴定及特性Table 1. The characteristics of identified ARF gene family in setaria italica推测蛋白质基因名
18、Genename转录名Genomicaccession No.染色体Chromosomedistribution位置Location外显子数No. ofextronORF 长度Open reading fragment length氨基酸(aa)Amino acid分子量 (kDa)Molecularmass等电点(pI)IsoelectricpointSiARF1 Si016262m 1 6988236-6994089 14 5853 907 99.70 5.45 SiARF2 Si016147m 1 8014441-8021664 14 7223 1133 125.42 5.90 SiAR
19、F3 Si016563m 1 27687425-27693417 14 5992 673 74.92 5.76 SiARF4 Si016559m 1 31927912-31930608 2 2696 674 72.31 6.86 SiARF5 Si021833m 3 165527-168181 3 2654 502 54.44 5.75 SiARF6 Si021223m 3 1163363-1171137 16 7774 835 92.76 6.30 SiARF7 Si021121m 3 1711800-1716887 13 5087 937 103.13 5.79 SiARF8 Si0216
20、13m 3 10559853-10564252 9 4399 569 63.30 9.14 SiARF9 Si021589m 3 13481509-13485320 8 3811 579 64.25 8.33 SiARF10 Si021216m 3 40156796-40163069 15 6273 841 92.74 6.25 SiARF11 Si021157m 3 49528177-49534101 14 5924 897 98.86 5.66 SiARF12 Si005753m 4 2680870-2687092 13 6222 1054 116.39 6.09 SiARF13 Si00
21、5741m 4 36454277-36461451 13 7174 1084 120.73 6.12 SiARF14 Si005991m 4 37696443-37700049 3 3606 686 74.70 7.05 SiARF15 Si005802m 4 38058036-38064273 15 6237 931 102.78 5.95 SiARF16 Si000540m 5 322788-326738 12 3950 687 76.88 5.59 SiARF17 Si004598m 5 32737893-32742284 9 4391 667 73.75 6.42 SiARF18 Si
22、000555m 5 37047017-37052754 10 5737 682 74.57 6.84 SiARF19 Si000415m 5 45466094-45471670 11 5576 754 84.62 7.60 SiARF20 Si013158m 6 32960517-32967626 13 7109 1096 121.32 6.13 SiARF21 Si009558m 7 20883443-20888473 14 5030 663 73.42 5.59 SiARF22 Si009541m 7 25115125-25117775 3 2650 677 72.67 8.05 SiAR
23、F23 Si025990m 8 26264617-27270550 15 5933 810 89.91 6.60 SiARF24 Si034525m 9 16301638-16305519 3 3881 684 74.71 6.71 2.2 谷子 ARF 基因家族的结构 蛋白的结构域分析利用 ProSite 软件分析每个 ARF 蛋白的结构域（图 1），结果表明，所有谷子 ARF 蛋白都含有植物特异的 B3 DNA 结合结构域和 ARF 结构域，且大部分序列都含有 Aux/IAA结构域，但 SiARF5、SiARF8、SiARF9、SiARF17、SiARF18 、SiARF19 和 SiAR
24、F22 含有2 个结构域，即只含有 B3 DNA 结合结构域和 ARF 结构域，没有 Aux/IAA 结构域。为进一步研究 ARF 基因的特征，获得基因的 DNA 序列和 RNA 序列，使用 GSDS2.0 软件得到谷子 ARF 基因的内含子 -外显子结构（图 1）。结果表明所有的 ARF 基因都具有内含子，内含子从 2 个（SiARF4）到 16 个（SiARF6），大多数基因的内含子在 10 个以上，从基因的结构特征可以初步分析基因的复制和扩增方式。利用 MEME 软件进一步分析谷子的24 个 ARF 蛋白的结构域，研究表明三个结构域又可以细分为 6 个基序，B3 DNA 结合结构域含有
25、1 个基序，ARF 结构域含有 3 个基序，Aux/IAA 结构域含有 2 个基序。B3 DNA 结合结构域的氨基酸组成较稳定，而 ARF 结构域和 Aux/IAA 结构域的序列变化较大，B3 DNA 结合结构域为植物特异性。图 1 谷子 ARF 蛋白的组织示意图。B3 DNA 结合结构域和 AUX/IAA 结构域分别用蓝色和橙色表示，ARF 结构域位于中间部位，用绿色表示Fig.1 The domain structure of ARF proteins, blue boxes represented B3 domain, green boxes represented ARF domain
26、 and orange boxes represented AUX/IAA domain.图 1 谷子 ARF 基因的结构 Fig.1 Gene structure of SiARF genes. The exons and introns were represented by blackboxes and gray lines2.3 谷子 ARF 基因家族染色体定位和基因扩增方式谷子共含有 9 条染色体，除 2 号染色体外，其余染色体上均含有 ARF 基因。图 12 可见 ARF 基因分布并不均匀，6 号、8 号和 9 号染色体上各只有 1 个 ARF 基因，7 号染色体上有 2 个 AR
27、F 基因，1 号、4 号和 5 号染色体上有 4 个 ARF 基因，3 号染色体上的 ARF基因最多为 7 个（图 2）。在 Phytozome 数据库中通过 Gbrowse 查看成簇分布的 ARF 基因家族成员与侧翼蛋白质编码基因的位置关系，同一家族的不同成员如果位于同一个或相邻的基因间区域，则这些成员为串联重复关系，按照此标准，谷子 ARF 基因家族的扩增不是通过串联重复来扩增。同时利用 MCSCAN 扫描 ARF 基因来研究基因的扩增模式，结果显示，谷子 ARF 基因的扩增分为两种模式：分散复制与片段复制。分散复制的基因有：SiARF1，SiARF5，SiARF6 ， SiARF7，Si
28、ARF9，SiARF10，SiARF11，SiARF12，SiARF14，SiARF16，SiARF19，SiARF20，SiARF23；片段复制的基因有：SiARF2，SiARF3，SiARF4 ， SiARF8，SiARF13，SiARF15，SiARF17，SiARF18，SiARF21，SiARF22，SiARF24。图 2 谷子 ARF 基因的染色体分布及扩增模式，箭头表示基因的方向Fig. 2 Chromosome distribution of ARF genes in setaria italica was identified, and gene duplication an
29、alysis of ARFs was also represented direction of transcription2.4 谷子 ARF 基因家族结构分析 蛋白家族结构分析利用 ProSite 软件分析每个 ARF 蛋白的结构域（图 3b），结果表明，大部分 ARF 序列含有 3 个结构域，即植物特异的 B3 DNA 结合结构域，ARF 结构域及 Aux/IAA 结构域，但 SiARF5、SiARF8、SiARF9、SiARF17、SiARF18、SiARF19 和 SiARF22 含有 2 个结构域，即只含有 B3 DNA 结合结构域和 ARF 结构域。利用 MEME 软件进一步分析
30、谷子的 24个 ARF 蛋白的结构域，研究表明三个结构域又可以细分为 6 个基序，B3 DNA 结合结构域含有 1 个基序，ARF 结构域含有 3 个基序，Aux/IAA 结构域含有 2 个基序。B3 DNA 结合结构域的氨基酸组成较稳定，而 ARF 结构域和 Aux/IAA 结构域的序列变化较大，B3 DNA结合结构域为植物特异性。2.5 4 谷子 ARF 基因家族分子进化树的构建通过对 ARF 蛋白序列的对比，按着 ARF 蛋白的结构域特征和蛋白的保守位点基序，分别绘制出 24 个谷子 ARF 蛋白的进化树（图 3a）。根据进化树的分支，可以将这些蛋白分为三组，其中，组可以进一步被分为两组
31、，即组a 和组b，组a 的 ARF 蛋白具有 3 个保守的结构域，组b 蛋白具有 2 个结构域。组占 ARF 蛋白多数，约 42%的 ARF蛋白位于组中（图 3a）。从进化树的聚类分析可见蛋白结构域相同的以及同一个基因的扩增或者复制的蛋白聚在一起，如 SiARF3 和 SiARF21 是片段复制的聚在一起，SiARF10和 SiARF23 为分散复制也聚在了一起，具有相同结构域的聚为一组。 为进一步研究 ARF基因的特征，使用 GSDS2.0 软件分析已获得的 DNA 和 RNA 序列，得到谷子 ARF 基因的内含子- 外显子结构（图 3b）。结果表明所有的 ARF 基因都具有内含子，内含子从
32、 2 个（SiARF4）到 16 个（SiARF6），大多数基因的内含子在 10 个以上，从基因的结构特征可以初步分析基因的复制和扩增方式。为了揭示谷子 ARF 基因家族的进化关系，将模式植物拟南芥 ARF 基因家族（23 个）和玉米（39 个）、水稻（26 个）、二穗短柄草（24 个）、小立碗藓（14 个）、葡萄（20个)和谷子（24 个）共 170 个 ARF 蛋白一起构建系统发育树，绘制 ARF 蛋白的进化树（图4）。通过绘制的进化树可以看出，170 个 ARF 蛋白可以聚为 12 个组，主要按进化的时间和亲缘关系聚类，可以聚为 4 个单子叶组、2 个双子叶组、1 个苔藓组和 5 个混合
33、组，按照进化分支可以分成 8 个不同的分支簇，单子叶植物、双子叶植物和苔藓类植物中的 ARF 蛋白呈现家族性聚集，不同纲目的植物间 ARF 蛋白也具有较高的同源性。图 3 谷子 ARF 家族的系统发育和结构域家族的系统发育和基因结构图 a 谷子 ARF 蛋白的系统发育进化树。24 个基因可被分为 3 组，组可进一步分为两组。图 b 谷子 ARF 基因结构图。黄色表示编码区，蓝色表示上下游序列，黑线表示内含子区。图 b 谷子 ARF蛋白的组织示意图。B3 DNA 结合结构域和 AUX/IAA 结构域分别用蓝色和橙色表示， ARF 结构域位于中间部位，用绿色表示Fig.3 Phylogenetic
34、 relationships among setaria italica ARF proteins were generated by neighbor-joining method. The 24 SiARF proteins were classified into three classes: I, II, III, and class I was further divided into twosub-classes Ia and Ib. b Gene structure of SiARF genes. The coding sequences were represented in
35、yellow. The upstream and downstream were represented in blue.The introns were represented by black gray lines.b The domain structure of ARF proteins, blue boxes represented B3 domain, green boxes represented ARF domain and orange boxes represented AUX/IAA domain.图 4 ARF 蛋白进化树，。所有蛋白被分为 4 组：单子叶（绿色）、双子
36、叶（红色）、苔藓（黑色）和混合组（黄色）Fig.4 Phylogenetic tree of ARF proteins in setaria italica, Arabidopsis,Zea mays,Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Physcomitrella patens and Vitis vinifera. The 170 ARF proteins were classified into four classes: monocot-specific group (green), moss-specific group (black), d
37、icot specific group (red) and mixed group(yellow) .2.6 5 谷子 ARF 蛋白的 3D 结构和保守序列分析使用 SWISS-MODEL 软件构建 ARF 蛋白的 3D 结构。结果显示，具有 B3 DNA 结合结构域的 ARF 蛋白含有 3 个 螺旋结构域和 7 个 折叠结构域。3 个 螺旋分别位于1 和 2 折叠、2 和 3 折叠、5 和 6 折叠之间（图 5）。第 2 个 -折叠片和连接环形成扳手状的结构，在此处可以为 DNA 的大沟结合留下大的空隙， 在 DNA 识别和结合的位点处具有两个“DNA 识别臂”可以和不同的位点识别，在蛋白的
38、 N-末端第 2 个-折叠和 2 个 -螺旋具有 5末端的识别序列，在 C 末端的第 4 和第 5 个 -折叠可以识别 3末端的位点。同时对谷子 ARF 蛋白的 3D 结构和其他物种相应蛋白的 3D 结构进行比较，如图 5 所示，得到的比值越小，蛋白 3D 结构越相似，和谷子 ARF 蛋白 3D 结构最相近的是单子叶植物中的水稻（0.01）、二穗短柄草（0.02）和玉米（0.03），双子叶植物中的黄豆（0.45）、苜蓿（0.89）和葡萄（1.35）距离较远，葫芦藓科的小立碗藓距离最远（1.64），ARF 蛋白的 3D 结构的比较和物种的亲缘关系有一定的相关性，即亲缘关系越近相似性越高。图 5
39、谷子 ARF 蛋白的 3D 结构分析， a: ARF 蛋白的 3D 结构; b: ARF 蛋白的 3D 结构和其他物种相应蛋白的 3D 结构进行比较; c: ARF 蛋白 B3 结构域保守序列（N 为氨基酸数量）Fig. 5 Close-up of B3 DNA binding domain. a: 3D structures of consensus sequences of B3 domains from 11 species. b: Cartoon of B3 domain. The B3 domain mainly consisted of seven-stranded b sheet
40、s and two short a helixes. c: Sequence constitution of B3 domains fromeleven species. N represented B3 domains number in surveyed eleven species. d RMSD values of superposed B3 domains from maize and other ten species2.7 6 谷子 ARF 基因的表达为进一步的了解 ARF 基因的特性和功能作用，研究基因的组织特异表达情况，除SiARF19 基因没有检测到表达，SiARF7 基因
41、在叶中没有表达，根中表达较微弱外，多数基因是组成型表达的，在不同的组织中均检测到基因的表达，如 SiARF21 和 SiARF23 在根、茎、叶和穗中表达量都很高，暗示着这两个基因有可能发挥多方面作用。不同的基因在不同部位表达量差异很大，如 SiARF2 在根中的表达值最高，SiARF23 在叶中的表达值最高，SiARF20 在茎和穗中表达值最高，基因在不同部位的表达差异及功能作用还需要进一步研究（表 2 图 6）。表 2 ARF 基因组织特异表达情况Table 2 The expression pattern of ARF gene in millet different tissue基因名
42、Gene name转录名Transcript name 根(RPKM) 叶(RPKM) 茎(RPKM) 穗(RPKM)SiARF1 Si016262m 15.57 0.77 6.71 14.14SiARF2 Si016147m 29.75 0.63 33.22 14.29SiARF3 Si016563m 15.65 8.28 35.42 21.29SiARF4 Si016559m 2.99 1.94 1.88 0.63SiARF5 Si021833m 0.24 0.41 1.15 2.29SiARF6 Si021223m 4.84 0.68 18.68 11.66SiARF7 Si021121m 0.04 0 0.16 2.23a bc
