1、响应面法优化贯叶连翘中金丝桃素超声提取工艺郭 凯 1,2，梁剑平 1*，华兰英 1，王学红 1，石广亮 3(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050; 2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)摘要:【目的】本文以贯叶连翘为原料，应用响应面法探求超声提取金丝桃素的最优工艺。 【方法】在对影响金丝桃素提取率的单因素系统考察的基础上，采用部分析因设计分析筛选以上因素，并应用响应面法对其显著因素进行研究和优化。 【结果】建立了超声提取贯叶连翘中金丝桃素的工艺数学模型。得到了超声提取金丝桃素的最佳
2、工艺条件：超声提取时间为 36.15 min、丙酮/乙醇混合提取溶剂中丙酮体积分数为68.14%、液料比为 11.87 mLg-1，此时金丝桃素提取率理论值可达到 1.454%。经验证，提取率为 1.44%，与理 1论值相符。得到主效应关系为：超声提取时间丙酮体积分数液料比。 【结论】通过以上实验得到的提取工艺条件可靠，金丝桃素提取率远高于常规提取方法，可为金丝桃素的工业化放大生产提供了一定的理论依据。关键词：贯叶连翘；金丝桃素；超声提取；部分析因设计；响应面法Optimization of ultrasonic extraction of hypericin in Hypericum per
3、foratum L. using response surface methodologyGUO Kai1, 2, LIANG Jian-ping1*, HUA Lan-ying1, WANG Xue-hong1, SHI Guang-liang3(1. Key Laboratory of New Animal Medicine Project Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Pharmacology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou Gansu 730
4、050;2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)Abstract: The objective of the current study was to determine the optimum ultrasonic extraction conditions for hypericin from Hypericum
5、perforatum L. The optimum conditions were evaluated with 2-level fractional factorial design and optimized using response surface methodology. High yields of hypericin were observed from Hypericum perforatum L. by ultrasonic extraction technology. The extraction time, acetone concentration and the r
6、atio of solvent to material were the most significant parameters on hypericin extraction as evaluated through FFD. The extraction conditions were further investigated with central composite design. The results showed that the optimal parameters for this method were: extraction time of 36.15 min, ace
7、tone concentration of 68.14(Vol) of acetone/ethanol solvent, and ratio of solvent to material of 11.87 mLg-1. Under the optimized condition, the maximum productivity of hypericin is 1.44%. The yield of hypericin under the optimized extraction conditions were great higher than that obtained from conv
8、entional solvent extraction. The present study demonstrates that ultrasonic is a great efficient tool for the fast extraction of hypericin from Hypericum perforatum L.Key words: Hypericum perforatum L.; hypericin; ultrasonic extraction; fractional factorial design; response surface methodology贯叶连翘(H
9、ypericum perforatum L.)为藤黄科金丝桃属植物，是近年来全世基金项目“十一五”国家科技支撑计划（2006BAD31B05）作者简介郭凯（1983-） ，男，山东济宁人，硕士研究生，主要从事中药提取工艺的研究；tel：13659319252，E-mail：。通讯作者梁剑平，研究员，博士生导师，研究方向：新型中兽药的研发；tel：13008781170，E-mail：。界最畅销的中草药之一。金丝桃素被认为是贯叶连翘提取物中最具生物活性的物质，具有多种药理作用，临床上已用于治疗基体细胞癌、胰腺癌、脑瘤等 1-4，体外试验发现其对多种病毒均有杀灭作用，国外已完成其抗艾滋病的期临床试
10、验 5。金丝桃素的特殊理化性质使得以往报道的方法所得产品收率过低 6，成为其进行深入研究的桎梏。本实验以金丝桃素提取率为考察指标，就该指标的超声提取的影响因素做了系统性研究。通过单因素考察，选取了 5 个因素做部分析因试验，对该试验确定的影响较大的 3 个因素采用响应面法进行了优化，所得工艺条件下金丝桃素提取率远高于其他工艺的报道，可为制药工业提供一定参考。1 仪器与材料1.1 材料与试剂贯叶连翘饮片，兰州安泰堂中药饮片有限公司，经中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽药室罗永江副研究员鉴定；金丝桃素标准品（纯度95%，lot code:142 311 810 609 064） ，Sigma
11、公司；乙腈和甲醇，色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司；去离子水，本实验室自制；其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。1.2 主要仪器 高效液相色谱仪，美国 VARIAN；DL-1000E 数控双频恒温模具超声波清洗机，上海之信仪器有限公司；JA2003N 型电子天平，购于上海精密科学仪器有限公司；Pine-tree 纯水机，北京湘顺源科技有限公司。2 实验方法2.1 金丝桃素提取精密称取贯叶连翘饮片5.00 g于100 mL三角烧瓶中，加入一定量的提取溶液，超声提取金丝桃素，提取后溶液稀释100倍，过0.45 um 高效液相色谱专用有机膜，用HPLC 检测其金丝桃素含量。全部实验应
12、在避光或弱光条件下进行。2.2 金丝桃素提取率的测定2.2.1 采用高效液相色谱法检测溶液中金丝桃素的含量 色谱柱为 Agilent HC-C18(5 m，4.6 mm250 mm)；流动相为乙腈:甲醇 :乙酸铵缓冲液(0.30 molL-1, pH=3.75)=50:40:10；检测波长 :588 nm；流速：1 mLmin -1；进样量:20 L ；柱温25 。2.2.2 标准曲线的制备 取1 mg对照品储备液置于5 mL容量瓶中，用甲醇依次稀释为10.0 gmL -1、5.0 gmL -1、2.5 gmL -1、1.25 gmL -1和0.625 gmL -1 5个浓度梯度。将各浓度对照
13、品按由低到高的浓度梯度，依次注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，所得平均峰面积分别为：6 841 386、3 390 944、1 683 622、844 042、440 529。以进样浓度（gmL -1）为横坐标，峰面积（S）为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程为y= 68 247x（R 2=0.999） 。结果表明:金丝桃素在进样浓度0.625 gmL -110.0 gmL-1范围内，呈现良好的线性关系。图1 金丝桃素的标准曲线Fig.1 Standard curve of hypericin2.2.3 金丝桃素提取率的计算金丝桃素提取率（%）=100%式中C 为提取液中金丝桃素含量，
14、mgmL -1；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数，本文为100倍；m为贯叶连翘质量，mg。2.3 单因素实验分别以不同的超声提取溶剂、溶剂浓度、溶剂加碱量、提取时间、提取功率、料液比、温度和提取级数等为因素，考察各因素对金丝桃素提取工艺的影响。2.4 部分析因试验根据单因素实验结果，采用五因素二水平的析因设计分析影响金丝桃素提取工艺的主要因素，进行实验因素筛选。2.5 响应面优化实验在单因素实验和析因试验基础上，确定影响金丝桃素提取工艺的显著因素，采用 Design Expert 7.1.6 统计分析软件的响应面法安排实验，以获取最优化工艺参数。3 结果与讨论3.1 单因素实验结果3.1.1
15、 超声提取溶剂对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 8份，分别置于 100 mL 三角烧瓶中。根据相关文献 6，分别加入无水甲醇（A） 、无水乙醇（B） 、无水丙酮（C） 、乙醇/水（体积比为 4:1）( D)、甲醇/ 丙酮（体积比为 1:1） （E） 、乙醇/丙酮（F） 、甲醇/乙醇（体积比为 1:1） （G） 、甲醇/乙醇/丙酮（体积比为 1:1:1） （H）60 mL，超声提取 1 h（超声功率为 150 W） ，上HPLC 检测。不同超声提取溶剂对金丝桃素提取率的影响如图 2 所示。由图可知，乙醇/丙酮（体积比为 1:1）作为超声提取溶剂时，金丝桃素提取率最高。
16、因此，选用乙醇/丙酮混合溶剂作为超声提取溶剂。图 2 提取溶剂对金丝桃素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction solvent on extraction yield of hypericin3.1.2 丙酮浓度对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 11 份，分别置于 100 mL 三角烧瓶中。然后分别加入丙酮体积分数为0%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、 80%、90%、100%的乙醇/丙酮溶液 60mL，超声提取 1 h（超声功率为 150W） ，上 HPLC 检测。不同丙酮浓度对金丝桃素提取率的影响如图 3 所
17、示。由图可知，随着丙酮体积分数的增加，金丝桃素提取率逐渐升高，当达到 70%时，金丝桃素提取率达到最大；再增加丙酮体积分数，金丝桃素提取率下降。因此，选用丙酮体积分数 70%作为混合溶剂配比最优值，乙醇体积分数选择在 50%90%作进一步优化。图 3 丙酮浓度对金丝桃素提取率的影响Fig.3 Effect of acetone concentration on extraction yield of hypericin3.1.3 溶液加碱量对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 12 份，分别置于 100mL 三角烧瓶中。根据相关文献 7，分别加入 NaOH 加入量为 0
18、 g、0.01 g、0.03 g、0.06 g、0.09 g、0.12 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g、0.30 g、0.35 g 和 0.40 g 的乙醇 /丙酮溶液（体积比为 3:7）50 mL，超声提取 1 h（超声功率为 150 W） ，上 HPLC 检测。不同加碱量对金丝桃素提取率的影响如图 4所示。由图可知，加碱明显提高金丝桃素提取率，可能原因是部分苯并二蒽酮类化合物在碱性条件下转化为金丝桃素，但 NaOH 过多会造成金丝桃素的分解。由于加碱量和提取率相关性不强，不考虑对此因素做进一步考察，选择质量浓度为 2.4 gL-1（即 0.06 moLL-1）作为提取溶剂加碱
19、量，与文献 7报道相同。图 4 NaOH 加入量对金丝桃素提取率的影响Fig.4 Effect of the NaOH content on extraction yield of hypericin3.1.4 超声提取时间对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 10份，分别置于 100 mL 三角烧瓶中。分别加入乙醇/ 丙酮溶液（体积比为 3:7，加NaOH 的质量浓度为 2.4 gL-1）60mL，超声提取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min（超声功率为 150 W） ，上 HPLC检测。不同超声提取时间对贯叶连翘中金丝桃素提取率的影响如图
20、 5 所示。由图可知，前 30 min，随超声时间增加，金丝桃素提取率升高， 30min 后，延长时间对金丝桃素提取率提高不明显。因此，选用 30 min 作为超声提取时间最优值，同时，超声提取时间选择在 2040 min 做进一步优化。图 5 超声提取时间对金丝桃素提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of hypericin3.1.5 超声波功率对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 8 份，分别置于 100 mL 三角烧瓶中。分别加入乙醇 /丙酮溶液（体积比为 3:7，加NaOH 的质量浓
21、度为 2.4 gL-1）60 mL，超声提取 50 min，超声功率分别为100、120、140、160、180、200、220、240 w，上 HPLC 检测，结果如图 6。随着超声功率的增大，金丝桃素提取率逐渐升高，到达 180 w 时，提取率达到最大；再增强超声功率，金丝桃素提取率下降明显。可能是大功率的超声波易导致金丝桃素分解，致使提取率下降。因此，选用 180 w 作为超声提取功率最优值，同时，超声提取功率选择在 160200 w 做进一步优化。图 6 超声提取功率对金丝桃素提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on extraction yi
22、eld of hypericin3.1.6 液料比对金丝桃素提取率的影响 精密称取 5.00 g 贯叶连翘饮片 10 份，分别置于 100mL 三角烧瓶中。分别加入乙醇/丙酮溶液（体积比为 3:7，加 NaOH的质量浓度为 2.4 gL-1）20、30、40、50、60、80、100、120、150、200 mL，180 w 功率提取 50 min，上 HPLC 检测，结果如图 7。达到 12 mLg-1 之前，随着液料液料比增加，金丝桃素提取率增加；达到 12 mLg-1 之后，提取率随液料比增加而减小。可能是因为增加提取溶剂量有利于金丝桃素的溶出，使得金丝桃素提取率增加，但当金丝桃素溶出已
23、基本达到平衡时，再加入大量提取剂不但不能增加提取率，还会阻碍超声波能量的传递，不利于金丝桃素的提取。因此，选用 12 mLg-1 作为料液比最优值，同时，料液比选择在 1014 mLg-1做进一步优化。图 7 液料比对金丝桃素提取率的影响Fig.7 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of hypericin3.1.7 不同提取温度对金丝桃素提取率的影响 提取时间为 50 min，超声波功率为 180 W，液料比为 12 mLg-1，分别加入乙醇 /丙酮溶液（体积比为 3:7，加NaOH 的质量浓度为 2.4 gL-1） ，考察不同提取温度对金丝桃素提取率影响，参见图 8。从图 8 可以看出，在 40 时金丝桃素提取率最高，可能是由于高温利于提取剂入侵细胞，有利于金丝桃素的溶出，但高于 40 时易引起金丝桃素降解。因此，选用 40 作为超声提取温度最优值，同时，超声提取温度选择在3050 做进一步优化。
