1、工业化提取分离纯化独一味总环烯醚萜苷类成分邱建国，张泉龙，尉丽力，李茂星，贾正平 *，张汝学，樊鹏程，周 珺（兰州军区兰州总医院 药材科，甘肃，兰州 730050 ）摘 要 目的 应用大孔吸附树脂结合聚酰胺柱色谱法富集分离独一味中总黄酮、总环烯醚萜苷及大极性成分实现工业化生产。方法 用 CCPP 系列层析设备进行分离富集，一阶导数紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷含量、高效液相色谱法测定山栀苷甲酯，8-O-乙酰山栀苷甲酯并考察不同洗脱条件下有效成分总环烯醚萜苷的变化。结果 采用 70 乙醇溶液为溶媒。大孔吸附树脂柱用“下进上出”的进样方式和“上进下出”的洗脱方式时，得率为 14.84 ，山栀苷甲酯
2、的转移率为 33.76 ，8O乙酰山栀苷甲酯的转移率为 32.99 。结论 此生产工艺方法及参数可以成功地将实验成果转化为工业化生产。关键词 独一味；总环烯醚萜苷；分离富集；工业化生产 中图分类号 R286; TQ460. 6 文献标识码 A Extraction and Purification of Total Iridoid Glycosides in Herba Lamiophlomis Rotata in IndustrializationQIU Jian-guo,ZHANG Quan-long,WEI Li-li,LI Mao-xing, JIA Zheng-ping*,ZHANG
3、 Ru-xue,FAN Peng-cheng，ZHOU Jun(Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital of PLA, Lanzhou 730050, China)Abstract:Objective The macroporous adsorptive resins vhromatotraphic column combining with polyamide chromatographic colum was used to separate the flavonoides, iridoid glycosides and maxim
4、us polarity ingredients in industrialization. Methods The flavonoides, iridoid glycosides and maximus polarity ingredients were separated and enriched by CCPP serial laminar analysis equipment, content of total iridoid glycosides ingredients was assaied by the first derivative spectrophotometry, con
5、tent of shanzhiside methylester and 8-o-acetyl shanzhiside methylester were determined by HPLC and change of total iridoid glycosides ingredients was investigated in different elution requirement. Results 70 % Alcohol was used as dissolvant. Using the “introduction from inferior surface” sample intr
6、oduction mode and “introduction from superior surface” eluting mode in the macroporous adsorptive resins, yield was 14.84 %, transfusion ratio for shanzhiside methylester and 8-o-acetyl shanzhiside methylester was 33.76 %,32.99 % respectively. Conclusion This production technology may transform expe
7、rimental achievement to industrial production successfully.Key words Herba Lamiophlomis Rotata，Total Iridoid Glycosides，separating and enriching，industrial production本课题组通过药理实验筛选，首次确定了独一味总环烯醚萜苷是独一味的止血、镇痛活性部位， 收稿日期 通讯作者 贾正平，主任药师，教授，博士生导师，主要从事医院药学专业的研究。Tel：09318994652；E-mail： 并应用现代天然药物化学分离方法，创造性地采用大孔吸
8、附树脂结合聚酰胺柱色谱法实现独一味中总黄酮、总环烯醚萜苷及大极性部分的富集分离，相关工艺流程获得国家发明专利，为藏药独一味的研究及二次开发打下了良好基础。本课题组将富集提取总环烯醚萜苷类成分工艺进行工业化生产，对工艺参数进行优选，但是工业化生产用的层析柱比较长，至少在 2.5 m，所以如何提高产品的得率和转移率，溶媒、洗脱速度、洗脱方式等工业化生产的关键参数需进一步优选研究。1 材料与设备独一味药材于 2004 年 5 月购自甘肃省玛曲县药材公司，经兰州大学药学院赵汝能教授鉴定为独一味 Lamiophlomisrotata(Benth.)Kudo；山栀苷甲酯，8-O-乙酰山栀苷甲酯（8-O-
9、acetyl shanzhiside- methylester）对照品 (由本研究室分离纯化并鉴定结构，HPLC 归一化法测定含量为97.5 )。柱层析用聚酰胺粉（1430 目）台州市路桥四甲生化塑料厂，20091022；XDA1 大孔吸附树脂，蓝晓科技有限公司特种树脂厂。1.1 仪器与设备高效液相色谱仪，Waters 960 泵，Waters 600 E 紫外检测器，C 18柱（4.6 mm150 mm，0.5m） ；HP 8453 二级管阵列紫外可见分光光度计，美国惠普公司；BP210 S 电子天平，Sartorius AG，德国；TN 型托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂；H.HS 电热
10、恒温水浴锅，红旗医疗器械厂；真空干燥柜，武汉制药机械厂；多能提取罐， HTN-0.3/0.2， 陕西三原宏达实业公司制造；层析柱，CCPP 系列层析设备，江阴市金确层析设备有限公司；真空浓缩罐， HTN-3， 陕西三原宏达实业公司制造；3200-25 磁力驱动泵，上海中耐制泵有限公司；真空灭菌干燥箱， MG12 A， 江苏常熟中药制药机械总厂2 方法与结果2.1 独一味水提物的制备称取独一味药材134 ，常水冲洗至无泥沙，至多能提取罐，加水适量（2/3 罐体处），浸润30 分钟，煎煮提取3 次（压力0.045 MPa），每次1 小时，提取液至贮罐，放凉，备用。2. 2 独一味水提取物进样：聚酰
11、胺柱（记为 1 号柱）和大孔吸附树脂柱（记为 2 号柱）串联，聚酰胺柱（记为 3 号柱）和大孔吸附树脂柱（记为 4 号柱）串联，聚酰胺柱（记为 5 号柱）和大孔吸附树脂柱（记为 6 号柱）串联，这三组串联柱再并联，见图 1 示。图 1 工业化分离、纯化独一味总环烯醚萜苷成分示意图Fig.1 Conceptual diagram of extraction and purification of Total Iridoid Glycosides in Habra Lamio phlomis Rotata in Industrialization装柱及其前处理：将每根聚酰胺柱装入聚酰胺粉 40 k
12、g，大孔吸附树脂柱 100kg 大孔吸附树脂装入中，常水冲洗至大孔吸附树进样速度：100 Lh -1进样方式：聚酰胺柱，上进下出；大孔吸附树脂柱，下进上出；即打开聚酰胺柱的“上进” 、 “上排” 、 “进料” 、 “串出”阀门，大孔吸附树脂柱的“下进” 、 “串进” 、 “上排” 、 “出料口”阀门，聚酰胺柱的“上排”管流出溶液时，关闭此阀门，大孔吸附树脂柱的“出料口”流出溶液稳定时，关闭此阀门。出料速度：100 Lh -1进样量：每隔 2 h 从聚酰胺柱出料口取样，进样 50 量之后，每隔 0.5 h 从聚酰胺柱出料口取样，用 AlCl3试剂荧光检测是否有黄酮类成分流出，以确定进样饱和度，如
13、果荧光检测有亮黄色荧光斑点，则说明有黄酮类成分流出，进样饱和，否则可以继续进样。各个参数及结果见表 1。表 1 进样速度及检测指标测定结果Table 1 The results of sample introduction parameter and detection index 时间（小时）1 号柱进样速度A1（L h-1）2 号柱进样速度B1（L h-1）1 号柱进样速度A2（L h-1）2 号柱进样速度 B2（Lh -1）1 号柱进样速度 A3（L h-1）2 号柱进样速度B3（Lh -1）1 号柱出料颜色 1 号柱出料 AlCl3试剂荧光检测0 100 100 50 50 100 1
14、00 淡棕色 阴性2 100 100 50 50 100 100 淡棕色 阴性4 100 100 50 50 100 100 淡棕色 阴性6 100 100 50 50 100 100 淡棕色 阴性7 100 100 50 50 80 80 淡棕色 阴性7.5 100 100 50 50 50 50 A1 柱棕色；A2、A2 柱淡棕色阴性8 100 100 50 50 50 50 A1 柱棕色；A2、A3 柱淡棕色A1 柱阳性；A2、A3 柱阴性8.5 / / 50 50 50 50 淡棕色 阴性9 / / 50 50 50 50 A3 柱棕色；A2 柱淡棕色A3 柱阳性；A2 阴性9.5 /
15、 / 50 50 / / 淡棕色 阴性10 / / 50 50 / / 淡棕色 阴性10.5 / / 50 50 / / 淡棕色 阴性11 / / 50 50 / / 淡棕色 阴性注：AlCl 3 试剂荧光检测阳性说明有黄酮类成分流出，阴性说明没有流出黄酮类成分。2. 3 常水洗脱，洗至无色聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱串联。上水速度：200 Lh -1上水方式：聚酰胺柱，上进下出；大孔吸附树脂柱，下进上出；2. 4 纯化水洗脱聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱串联。纯化水 120 L 洗脱，聚酰胺柱洗脱终液取样，HPLC 测定洗脱情况，见图 2。2. 5 70 乙醇溶液洗脱聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱采用并联。
16、用 70 乙醇溶液 140 kg 分别洗脱聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱，洗脱至有乙醇味，大孔吸附树脂柱取样；停止洗脱，浸泡 2 小时，大孔吸附树脂柱浸泡溶液取样；继续洗脱，洗脱速度 40 Lh-1，洗脱方式“上进下出” ，洗脱结束，大孔吸附树脂柱洗脱溶液取样；用纯化水洗脱，将树脂柱中的残留乙醇洗脱下来，收集乙醇洗脱溶液。HPLC 测定大孔吸附树脂柱洗脱情况，见图 2。图 2 工业化生产纯化、分离不同阶段分离物 HPLC 图A.2 号柱纯化水；B.2 号柱 70 %乙醇洗脱初液；C.2 号柱乙醇浸泡；D.2 号柱 70 %乙醇洗脱物Fig.2 HPLC Chromatograms of isolat
17、e production in different progression of purification and sepration in industrialization2. 6 回收乙醇洗脱溶液，并减压浓缩干燥、粉碎成粉将乙醇洗脱溶液进行减压回收乙醇，回收后的洗脱物减压浓缩干燥，温度控制在 80以下。干浸膏超微粉碎成细粉，按 2.8 项下进行总环烯醚萜苷、山栀苷甲酯、8 -O-乙酰山栀苷甲酯的含量测定，并计算得率及其转移率，结果见表 2。2. 7 聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱的再生利用聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱采用并联。配制 0.1 molL-1的氢氧化钠溶液适量，冲洗至无色；配制 0.1
18、molL-1的盐酸溶液适量，冲洗；用常水冲洗至中性，用 95乙醇溶液保存。洗脱速度 300 Lh-1，洗脱方式“上进下出” 。2. 8 含量测定总环烯醚萜苷类成分含量测定一阶导数紫外可见分光光度法 1：对照品溶液的制备：称取 8 -O-乙酰山栀苷甲酯对照品 20.4 mg，精密称定，置 100mL 容量瓶中，蒸馏水溶解并定容，得对照品溶液。工作曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 于 10 mL容量瓶中，蒸馏水定容，测定 A（253 nm） ，以浓度为横坐标、吸收度值为纵坐标作工作曲线图和回归方程：A=-0.001 C + 0.0002
19、供试品溶液的制备：称取洗脱物细粉 0.01 g，精密称定，置 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解定容至 100 mL，一阶导数法测定，结果见表 2。山栀苷甲酯和 8-O-乙酰山栀苷甲酯的含量测定 2 3 ： 照高效液相色谱法（中国药典2010 版 一部 附录 VI D）测定。色谱条件与系统适用性试验： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以 9%乙睛溶液和 15乙睛溶液为流动相，梯度洗脱（011 分钟，9乙睛溶液；1124 分钟，15乙睛溶液；2431 分钟，9%乙腈溶液） ，检测波长为 235 nm。理论塔板数按山栀苷甲酯和 8-O-乙酰山栀苷甲酯峰计算应不低于1500。对照品溶液的制备：分别
20、称取对照品山栀苷甲酯，8-O-乙酰山栀苷甲酯适量，制成每 mL 含山栀苷甲酯和 8-O-乙酰山栀苷甲酯均为 35 g。供试品溶液的制备：分别称取独一味药材 0.5 g，洗脱物细粉 0.06 g，精密称定，置 25 mL 具塞锥形瓶中，精密加入 70甲醇溶液 25 mL，称定重量，超声提取（功率 250 W,频率 50 kHz）30 分钟，放冷，称定重量，补足重量，滤过，滤液备用。测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 L，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见表 2，图 3。图 3 独一味对照药材及洗脱物 HPLC 图A. 对照品；B. 独一味对照药材；C. 洗脱物；1. 山栀苷甲酯；2
21、. 8-O- 乙酰山栀苷甲酯Fig.3 HPLC Chromatograms of Habra Lamio phlomis Rotata and eluate 表 2 水提物和洗脱物含量测定及转移率、得率计算Table 2 The results of assaying and transfusion ratio and yield of aqueous extract and eluate注：转移率（）洗脱物中的含量成品量/（水提物中的含量投料量）100得率（）成品量/投料量 100批号 总环烯醚萜苷质量分数/gg-1，山栀苷甲酯质量分数/gg-1，8-O-乙酰山栀苷甲酯质量分数/gg -1
22、，投料量/kg成品量/kg总环烯醚萜苷转移率/山栀苷甲酯转移率/8-O-乙酰山栀苷甲酯转移率（）得率（）备注（大孔吸附树脂柱上样方式）水提物 2009-1 16.14 1.82 1.94 20 上进下出水提物 2009-2 16.04 1.92 2.14 42 下进上出水提物 2009-3 16.08 1.91 2.05 31 下进上出水提物 20101 17.68 2.03 1.94 48.8 下进上出水提物平均 16.49 1.92 2.02 洗脱物 20091 53.94 7.20 7.02 1.30 21.72 25.72 23.54 6.50 上进下出洗脱物 20092 57.91
23、7.772 6.951 9.10 78.22 87.80 70.41 21.67 下进上出洗脱物 20093 57.77 7.366 7.107 6.40 74.17 79.49 71.71 20.65 下进上出洗脱物 20101 52.74 6.25 6.21 9.80 59.91 61.80 64.10 20.08 下进上出洗脱物平均 55.59 7.15 6.82 8.43 70.77 76.36 68.74 20.80 SD 9.62 13.28 4.07 0.80 RSD(%) 13.60 17.39 5.92 3.86 3. 讨论3.1 应用聚酰胺富集、分离独一味中的总黄酮，大孔吸
24、附树脂富集、分离独一味总环烯醚萜苷类成分的进行工业化生产，如何将不同的成分在 2.5 m 长的柱子上进行分离、富集并且尽可能降低成本，洗脱速度的控制很重要，如表 1，速度太快，成分会冲洗下来，达不到分离富集的效果；速度太慢，会增加成本；通过反复实验、摸索，进样时，选用 A3 柱的速度较好，即在50 进样量速度相对快一点；后面则慢点。洗脱吸附在大孔吸附树脂上的总环烯醚萜苷类成分时，70 乙醇溶液注满柱子后先浸泡 2 小时以后再用较低速度洗脱。3.2 如何提高洗脱物的得率和转移率，除了洗脱速度的影响，还与进样方式和洗脱方式有很大的关系，尤其大孔吸附树脂柱，如用“上进下出”的进样方式和“上进下出”的
25、洗脱方式时，结果截然不同，如表 2 中水提物 2009-1 和洗脱物 20091 即采用“上进下出”的洗脱方式，得率为 6.5 ，总环烯醚萜苷、山栀苷甲酯、8O乙酰山栀苷甲酯的转移率分别为 21.72 、25.72 ，23.54 ；反之用“下进上出”的进样方式和“上进下出”的洗脱方式时（表 2 中水提物 2009-2、2009-3、2010-1 和洗脱物 20092、2009-3、2010-1），得率为 20.80 ，总环烯醚萜苷、山栀苷甲酯、8O乙酰山栀苷甲酯的转移率分别为 70.77 、76.36 、68.74 ；因为采用“下进上出”的方式，成分大多数富集在下部，用“上进下出”的方式洗脱更容易洗脱下来。3.3 根据各项测定数据，此生产工艺方法及参数较成功地将实验成果转化为工业化生产。参考文献：1 李茂星，贾正平，沈 涛.分光光度法测定藏药独一味及其制剂中总环烯醚萜苷的含量.中药新药与临床药理.2006，17（1）：45472 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部） ， M.北京.化学工业出版社，2010：184185，541.3 桑国卫，中国药品检验标准操作规范，中国医药科技出版社，2005 年，6 月.
