1、基金项目：上海市自然科学基金（15ZR1436600） ；大麦青稞产业技术体系（CARS-05） 。作者简介：李颖波，博士，助理研究员。研究方向为植物分子细胞遗传。E-mail : 通信作者：黄剑华，博士，研究员。主要从事细胞工程育种和相关机理研究。E-mail : 大麦 HvLEC1 基因的克隆及其表达特征分析李颖波 1, 2*，郭桂梅 1, 2，刘成洪 1, 2，何婷 1, 2，高润红 1, 2，徐红卫 1, 2，陈志伟 1, 2，陆瑞菊 1, 2，黄剑华 1, 2*， （ 1上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106； 2上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106）摘要：
2、植物 LEC 蛋白是 NF-Y 转录因子的一类 B 亚基，在植物胚状体形成过程中起重要作用。为了研究大麦小孢子体外培养形成胚状体的机理，本研究利用 RACE 技术在大麦中克隆了一个大麦新的 HvLEC1 基因，该基因 cDNA 全长为 1004 bp，开放阅读框全长为 597 bp ,，编码 198 个氨基酸，其蛋白 1-59 位氨基酸含有 LEC 结构域，命名为 HvLEC1。HvLEC1 在大麦的根、茎、叶和小孢子培养过程中均能表达，其中小孢子培养 7 天时表达量最高；对两种不同大麦材料 BI04、基 19 小孢子培养 7（d）天时 HvLEC1 在大麦材料品系 BI04 中的表达量比基
3、19 高，BI04 愈伤产量也比基 19 高，和 19 d 愈伤产量分析表明，HvLEC1 表达量和愈伤产量有相关性；受盐胁迫后 HvLEC1 在大麦的根中快速上调表达，推测提示 HvLEC1 的功能与小孢子胚状体发生和逆境胁迫响应相关的功能 可能不仅参与与小孢子胚状体发生和，而且参与盐胁迫响应相关。关键词：大麦；转录因子；小孢子；胚状体发育发生；盐胁迫；表达Cloning and expression analysis characterization of HvLEC1 in Hordeum vulgare L. Li Yying-bo1, 2*, Guo Ggui-mei1, 2, Li
4、u Ccheng-hong1, 2, He Tting1, 2, Gao Rrun-hong1, 2, Xu Hhong-wei1, 2, Chen Zzhi-wei1, 2, Lu Rrui-ju1, 2, Huang Jjian-hua1, 2*（ 1Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106; 2Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201106）Abst
5、ract: Plant LEAFY COTYLEDON (LEC) proteins , which belong to the NF-Y transcript factor B subunit, which play central role in plant embryogenesis. To investigate the mechanism in of microspore induced embryo of in vitro in bBarley, a novel LEC gene, HvLEC1, was cloned from bBarley using the RACE met
6、hod. The isolated full-length cDNA sequence of HvLEC1 was 1004 bp, containing a 597-bp open reading frame (ORF) coding for 198 amino acids. The deduced amino acid sequence of HvLEC1 contained a LEC domain located between amino acids 1 and 59. HvLEC1 can be detected in roots, stems, leaves, and diffe
7、rent days of the cultured microspores, and presented the highest expression in 7 days of cultured microspores. The expression of HvLEC1 at 7 days of cultured microspores in BI04 was higher in barley line BI04 than that in barley line Ji19 at 7 days of cultured microspores, and callus yield at 21 day
8、s of cultured microspores of was also higher in BI04 was more than that in Ji19 at 21 days of cultured microspores, indicatin, which revealed ged that there might be a has correlation between the expression level of HvLEC1 and might be in a consistent with the callus yield. The expression of HvLEC1
9、can also be quickly up-regulated in barley root by salt stress, which suggested that the gene of HvLEC1it may play a role in may be involved in not only microspore embryogenesis and but also the responses to abiotic salinity stress of barley.Key words: Hordeum vulgare L.; transcript factor; microspo
10、re; embryogenesis; salt stress; expression大麦是重要的谷类作物，具有食用、饲用、酿造和医用等多种用途 1。小孢子培养是由单细胞向多细胞转化的过程，小孢子培养体系在作物优良农艺性状聚合和耐逆、抗病定向筛选上有重大的潜力，并已成功运用于大麦育种 2，同时由于其单倍体特性，小孢子培养体系也是进行发育和抗逆相关基因研究的理想平台 3。另外，大麦的耐逆性强，是禾谷类中较为耐盐的作物 4，研究大麦的耐盐机制可以为其他禾本科作物提供参考。核因子 NF-Y (nuclear factor Y，NF-Y)，也称为血红素激活蛋白（ heme activator prote
11、in，, HAP）是一类普遍存在于酵母、动物、植物等真核生物中的转录因子，在植物生长发育、对外界应激反应中发挥重要调控功能 5。NF-Y 通常由 A、B 、C 三个不同亚基形成异源三聚体，其中 B 亚基（NF-YB ）在 NF-Y 转录因子三聚体与 DNA 的特异性结合中起作用 6, 7。NF-YB 在酵母和动物中，只有一个编码基因，而在植物中有多个 NF-YB 基因 8-10。植物 NF-YB 蛋白中 16 个氨基酸组成的特异序列将其区分为 LEC-1 和非 LEC-1两类，其中 LEC-1 是植物胚胎形成的关键调控因子，拟南芥中 AtLEC1 是种胚发育的关键基因，可诱导营养细胞分化为胚性
12、细胞 11。NF-YB 基因还在调控植物花期和逆境胁迫反应中起着重要作用 12-14。大麦中已鉴定出 5 个 NF-YB 基因中，在拟南芥中过量表达 HvNF-YB1 可以使花期比野生型提前 15。NF-Y 转录因子在受盐胁迫后的作用的研究主要集中在 NF-Y 的 A/C 亚基上 16, 17，而对 NF-YB 亚基研究较少。本研究在大麦中克隆得到一个新的 NF-YB 亚基基因，并通过对该基因小孢子培养过程中的表达分析和在盐胁迫大麦根中的表达分析，表明该基因可能在在大麦小孢子胚状体愈伤诱导发生和对盐胁迫响应中起着重要发挥作用不仅参与小孢子胚状体发生，而且参与盐胁迫响应。1 材料与方法：1.1
13、实验材料大麦材料为本实验室育成的大麦品种大麦材料由上海市农业科学院生物技术研究所育成的大麦品种“花 30”，是江、浙、沪审定推广的大麦品种 18。1.2 大麦小孢子培养大麦小孢子培养参照陆瑞菊等 2方法，在培养 3 d，7 d，19 d 时取样，用于总 RNA 提取。小孢子诱导愈伤产量，在培养 21 d 天时对愈伤称重获得。1.3 NaCl 处理大麦幼苗对大麦品种花 30 种子发芽幼苗进行水培，二叶一心期时培养液中加入 NaCl 至浓度为 300 mM，以不作任何处理的幼苗为对照，取处理后 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h 、24 h 的大麦幼根，用于总 RNA 提取。同时取对
14、照 0 h 小时的根、茎、叶用于不同组织部位 RNA 提取。1.4 大麦总 RNA 的提取和 cDNA 第 I 链的合成大麦总 RNA 提取采用 Trizol 方法进行，利用 DNase I 去除 RNA 中残留的少量 DNA。所提取的 RNA经 Nano-drop 测定 OD230、OD 260、OD 280 吸收值以检测纯度，同时采用 1%甲醛变性胶电泳检测 RNA 的完整性。经检测完整性好、纯度高的总 RNA 用于 cDNA 第链合成，具体步骤参照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Life）说明书进行。1.5 大麦 HvLEC1 基
15、因全长克隆、序列分析根据拟南芥 (Arabidopsis thaliana) NF-YB1(GenBank序列号：NM_102046.4)及玉米、玉米( Zea may) ZmNF-YB2（GenBank 序列号：NM_001112048.1） 、油菜（Brassica napus） （GenBank 序列号：GU945398.1，GU945399.1） 、野生大豆（Glycine latifolia） （GenBank 序列号：EU088290.1）、水稻（Oryza sativa） （GenBank 序列号：AY062185.1 ， AY062184.1） 、卷柏（Selaginella
16、moellendorffii）（XM_002969253.1，XM_002986769.1）的核苷酸序列，设计3-RACE扩增（因3-RACE 扩增直接获得了目标基因全长，因此未设计5-RACE 扩增引物）基因特异性简并引物GSP1（5-ATCGCVAACGTSATCCGSATCAT-3） ；） ，GSP2：（5- ATCGCVAACGTSATCCGSATCAT-3） 。利用3 端PolyA锚定引物 AP1（5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ）反转合成3-端cDNA库，GSP1、 AP1进行PCR扩增，再利用GSP2 和AP2（ GGCCACG
17、CGTCGACTAGTAC）进行巢式扩增。使用热启动双封闭DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase进行 PCR扩增，扩增条件为：94 5 min；94 30 s，51 30 s，72 1 min，35个循环；72 20 min。扩增完成后使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 回收目的基因条带(1004 bp)。将目的基因片段与克隆载体pMD18-T连接, ， , 转化大肠杆菌XL-blue-MRF感受态细胞，涂LB氨苄抗性平板 , 过夜生长，挑取单克隆，以基因全长引物进行菌落 PCR验证，送深圳华大基因公司以通用引物M13进行双向测序。获得的序列在大麦基因组数
18、据库(http:/webblast.ipk-gatersleben.de/barley/index.php)分别Blastp和Blantx，检验基因是否包含ORF全长。1.6 生物信息学分析采用 Expasy 的 ProtParam 在线分析软件 Domains 数据库 (http:/web.expasy.org/protparam/)分析HvLEC1 蛋白中各种氨基酸含量，并预测理论分子量和等电点。利用 Clustal X 1.83 软件进行多重序列比对，采用 MEGA 4.1 软件通过 neighbor-joining 方法构建系统进化树，其中 bootstrap 设为 1000 repl
19、icates。1.7 荧光定量 PCR (qRT-PCR)分析根据 HvLEC1 基因序列设计 Q-PCR 引物：上游引物 5-CGTGGCGAGCATCTAGTTTT-3，下游引物 5-TTGCAAGACGGTTTGATCCC-3；采用大麦的 Actin 基因作为内参（引物为：Actin-F：5-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3；Actin：5-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3） 。 Q-PCR 反应体系：按照说明书在冰上配制 20 L反应体系，包括 1SYBR Mix (ToYoBo, Japan)，上、下游引物各 0.4 mol/L，每个反应含大约 30 ng
20、的 cDNA，每个反应包括 3 个重复，以不加模板作为阴性对照。Q-PCR所用仪器为 ABI 7500。PCR 反应程序为： 94 预变性 30 s；94变性 5 s，60退火 20 s，72 延伸 20 s，45 个循环。反应结束后，根据得到的 CT 值，利用 2-CT 计算相对表达量。通过产物溶解曲线分析 Q-PCR 引物扩增的特异性。2 实验结果2.1 HvLEC1 的克隆和生物信息学分析为了克隆大麦 NF-YB 基因，利用拟南芥和玉米中 NF-YB 基因设计简并引物，利用 3 RACE 获得一个 1 Kb 左右片段，克隆测序并和大麦基因组数据库比对后发现，该片段序列对应编码基因MLOC
21、_36682.1，mRNA 全长为 1004 bp，编码长度为 198 个氨基酸的多肽链（图 1） 。预测分析表明，该基因编码蛋白的分子量为 21.68 kDa，等电点(pI) 为 6.66。和不同物种中已报道的 LEC 蛋白序列比对分析，结果表明该基因编码蛋白含有 LEC 保守结构域典型的三个 螺旋，但是相对其它蛋白在 N 端缺失一段序列（图 2） ，属于 LEC 类 NF-Y 转录因子 B 亚基蛋白，所以该基因命名为 HvLEC1(GenBank 序列号：KT726906)。图 1 大麦 HvLEC1 基因的 cDNA 与推导的氨基酸序列Figure 1 The cDNA sequence
22、 and its deduced protein sequence of barley HvLEC1图 1 大麦 HvLEC1 基因的 cDNA 与推导的氨基酸序列Figure 1 The cDNA sequence and its deduced protein sequence of bBarley HvLEC1 图 2 HvLEC1 与不同物种 LEC 蛋白序列比对Figure 2 Alignment of HvLEC1 with its homologs in other species图 2 HvLEC1 与不同物种 LEC 蛋白序列比对Figure 2 Alignment of H
23、vLEC1 with its homologs in other species 2.2 HvLEC1 与大麦及其它近源物种中的同源蛋白聚类关系分析通过 blastp 搜索 NCBI 非冗余蛋白质数据库，查找不同物种的同源蛋白，进行多重序列比对，并构建系统进化树。HvLEC1 和水稻的 NF-YB 蛋白 HAP3 在一个 cluster中，而大麦中 HvNF-YB1HvNF-YB5蛋白位于一个 cluster中， （图 3） 。表明 HvLEC1 和 HvNF-YB1HvNF-YB15 亲缘关系较远，可能在功能上也有很大差异。图 3 部分禾本科植物 LEC 同源蛋白的系统进化树。Figure
24、3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of LEC from different plant species.GenBank 序列号：ZmLEC1 (NP_001105518.1)，SiNF-YB2 (XP_004953763.1)，ZmNF-YB2 (XP_008679062.1)，OS-HAP3 (AAL47209.1)，HvNF-YB1 (JF764600)，HvNF-YB2 (JF764601)，HvNF-YB3 (JF764602)，HvNF-YB4 (JF764603)，HvNF-YB5 (JF764604)。图
25、 3 部分禾本科植物 NF-YB 同源蛋白的系统进化树。Figure 3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of HIPPs from different plant species.GenBank 序列号：ZmLEC1 (NP_001105518.1)，SiNF-YB2 (XP_004953763.1)，ZmNF-YB2 (XP_008679062.1)，OS-HAP3 (AAL47209.1)，HvNF-YB1 (JF764600)，HvNF-YB2 (JF764601)，HvNF-YB3 (JF764602)，HvNF
26、-YB4 (JF764603)，HvNF-YB5 (JF764604)。2.3 HvLEC1 在大麦不同组织中的表达分析为了验证 HvLEC1 是否在小孢子培养过程中发挥作用，我们对大麦品种花 30 做小孢子培养，并在培养 3 d 时开始出现多细胞结构（multi cellular structure, MCS） ，7 d 时有大量多细胞结构形成，观察到有少数类胚状体结构(embryoid body like structure, ELS)形成；19 d 时形成成团愈伤组织（图 4） ，在这三个时间点取样提取总 RNA，对 HvLEC1 进行表达分析。结果表明，以幼根中表达量为标准，结果表明
27、HvLEC1 在大麦小孢子培养过程中的表达量很高，培养 3 d 小孢子中 HvLEC1 表达量为幼根的 163 倍，培养 7 d 时为根的 330 倍，到第 19 d 时，表达量有所下降为根中的 79 倍；HvLEC1 在幼茎中的表达量是根中的 3 倍d；在幼叶中的表达量和根中一致（图 5） 。图 4 不同培养时间小孢子。a ：3 天，b：7 天，c：19 天。图 4a 中红色箭头表示多细胞结构；图 4b 中红色箭头表示胚状体结构。Figure 4 Different days of cultured microspores. a: 3d，b: 7d，c: 19d. The red arrow
28、s in figure 4a indicate MCS, the red arrows in figure 4b indicate ELS.图 4 不同培养时间小孢子。a ：3 天，b：7 天，c：19 天。图 4a 中红色箭头表示多细胞结构；图 4b 中红色箭头表示胚状体结构。Figure 4 Different days of cultured microspores. a: 3d，b: 7d，c: 19d. The red arrows in figure 4a indicate MCS, the red arrows in figure 4b indicate ELS.图 5 HLEC
29、1 的组织特异性表达分析Figure 5 Expression pattern of HvLEC1 in different tissues of barley图 5 HLEC1 的组织特异性表达分析Figure 5 Expression pattern of HvLEC1 in different tissues of bBarley2.4 不同大麦品种中的 HvLEC1 表达和愈伤产量为了验证 HvLEC1 表达是否和愈伤的形成相关，我们使用相同重量的 BI04 和基 19 两个品种小穗进行小孢子培养，检测了两个品种小孢子培养 7 天时的 HvLEC1 表达量和 21 天时愈伤的产量。结果
30、表明，在小孢子培养 7 天时 HvLEC1 在 BI04 材料中表达量是基 19 的 2.4 倍（图 6） 。而在培养 21 天时，BI04 材料愈伤的平均产量为 39.85 g，而基 19 材料愈伤的平均产量 22 .525 g，两种材料愈伤产量差异显著（表 1） 。 图 6 HLEC1 在小孢子培养 7 天时基 19 和 BI04 中的表达Figure 6 Expression of HvLEC1 in Ji19 and BI04 at 7 days of cultured microspores图 6 HLEC1 在小孢子培养 7 天时基 19 和 BI04 中的表达Figure 6 E
31、xpression of HvLEC1 in Ji19 and BI04 at 7 days of cultured microspores表 1 两种大麦材料小孢子培养 21 天愈伤产量Table1 The callus of two different bBarley materials at the twenty-first21 days of cultured microspores2.5 HvLEC1 在受盐胁迫 后的大麦根中的表达分析为了验证 HvLEC1 是否参与大麦耐盐机制，我们对大麦幼苗进行了盐胁迫处理。根部是最早接触 NaCl并且产生防御反应的组织，qRT-PCR 结果表明
32、，在受到盐胁迫的大麦根中，HvLEC1 的表达量快速上调，在受胁迫 1 h 时 HvLEC1 表达量比诱导前高 4 倍，在 2 h 时达到峰值，然后表达量下调，在 6 h 时表达量下调到诱导前的 3 倍；在后续的时间中，HvLEC1 的表达量继续上调，到 24 h 时达诱导前的 20 倍（图 7） 。这表明 HvLEC1 可能参与大麦根部对盐分胁迫的响应。图 7 HvLEC1 在受盐胁迫大麦根中的表达分析Figure 7 Expression pattern of HvLEC1 in roots of barley in response to salt stress材料 重量（ mg）平均重
33、量（ mg）显著性 t 测验培养 1 23.7培养 2 22.6培养 3 22.9基 19培养 4 20.922.525培养 1 41.1BI04培养 2 38.639.85p0.01图 7 HvLEC1 在受盐胁迫大麦根中的表达分析Figure 7 Expression pattern of HvLEC1 in roots of bBarley in response to salt stress3 讨论植物中的 NF-YB 转录因子有多种，而且序列长短各不相同 19。HvLEC1 和其它物种中的 LEC 类蛋白序列比较在 N 端缺失一段序列，和这种情况相符。对 HvLEC1 与大麦和其它禾
34、本科作物中的 NF-YB 蛋白进行聚类关系分析发现，HvLEC1 和大麦中已报道的 5 个 NF-YB 蛋白亲缘关系较远；这也验证了 NF-YB基因在进化上具有多样性，而且发挥的功能也可能不同。柑橘（Citrus sinensis）的 NF-YB 亚基基因 CsLIL 在愈伤中表达表达丰度很高，并且在营养器官中表达该基因可诱导产生胚性组织 20。葡萄（Vitis vinifera L.） 中的 VvL1L 在愈伤转到诱导培养基 4-6 周时表达量较高 21。本研究显示，HvLEC1 在大麦的根、茎、叶、培养不同时间点小孢子中均能表达，但是培养不同时间点小孢子表达量都较高，而且在小孢子培养 7
35、d 时表达量最高。培养 7 d 时，大麦小孢子形成大量多细胞结构，同时有少量形成类胚状体结构，是小孢子胚状体发生（embryogenesis）的关键时期 22。进一步的实验表明，培养 7 d 时 HvLEC1 基因和 21 d 愈伤产量有相关性。而 LEC 基因在拟南芥体细胞培养中对愈伤的产量起调控作用 23，这提示 HvLEC1 可能在大麦小孢子胚状体发育过程中起重要作用，其功能有待于下一步的验证。研究表明，NF-Y 转录因子在植物的耐逆反应中起着重要作用，过量表达 AtNF-YB1 和 ZmNF-YB2 可显著提高拟南芥和玉米植株对干旱的耐受性 14。拟南芥的 AtHAP5A 通过结合 A
36、tXTH21 的来正调控抗冷性，抑制活性氧积累，激活 ABA 途径基因的表达 24，而 NF-YA1 基因负调控对盐和 ABA 的耐性 16。在水稻中过表达百慕大草 CdtNF-YC1 基因可增强植株的耐盐性 17。本研究中，受到盐胁迫的大麦根中后，HvLEC1 快速上调表达，并且在后续时间中维持高表达水平，这表明 HvLEC1 可能在大麦对盐胁迫反应中起作用。但 HvLEC1 是否起正向调控作用需要进一步的研究。参考文献：1 卢良恕. 中国大麦科学M. 中国农业出版社, 1996, 2-10.出版社？2 陆瑞菊, 黄剑华, 何南扬, 等. 应用小孢子离体培养技术培育大麦新品系J. 麦类作物学
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