1、第二部分 大会交流论文135羟基磷灰石纳米颗粒介导的 NR2B-siRNA对小鼠炎性痛的影响中南大学湘雅三医院麻醉科 杨 慧 黄 东 欧阳文 廖 琴目的 观察羟基磷灰石纳米颗粒（HA）介导的 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体 2B 亚基（NR2B）小干扰 RNA（siRNA）鞘内转染后对小鼠福尔马林所致炎性痛的影响以及脊髓背角 NR2B蛋白表达的变化，初步探讨羟 基磷灰石纳米颗粒作为 NR2B-siRNA 体内转染载体的可行性。方法 采用化学共沉淀-水热合成法制备 HA，用 琼脂糖凝胶电泳法及紫外分光光度计检测HA 对 NR2B-siRNA 的结合能力和该复合物在生理盐水中的 稳定性。
2、 选用体重约 18-20g 的成年雄性昆明种小鼠 48 只，随机分 为六组。 第一组（HN 组，8 只）：以 HA 为载体，将 NR2B-siRNA 鞘内转染小鼠；第二组（PN 组， 8 只）：以聚乙烯亚胺(PEI)为载体，同样的方法将 NR2B-siRNA 鞘内转染小鼠；第三组（HG 组，8 只）：用 HA 作载体，将非特异性的 绿色荧光蛋白（GFP）的 siRNA 鞘内转染小鼠，作为 NR2B-siRNA 的阴性对照；第四组（HA 组， 8 只）：鞘内给予小鼠同等容积的灭菌 HA 混悬液；第五组(NS 组 ，8 只）：鞘内给予小鼠同等容 积的无菌生理盐水；第六组（BC 组，8只）：只行鞘内
3、穿刺术，不注射任何溶液。术后第 7 天，各组均经右足底皮下注入 1%福尔马林20ul，行为学检测小时。福尔马林试验后，各组立即取腰段脊髓用于脊髓切片的 NR2B 免疫组化检测。结果 对羟基磷灰石纳米颗 粒进行透射电镜分析发现颗粒呈细条状或短棒状，分散 较均匀, 一维尺寸约 40-50nm。在酸性和中性条件下， HA 能与 NR2B-siRNA 以 35：1 及以上的质量比完全结合，但在碱性条件下与 NR2B-siRNA 结合能力弱；且 HA/NR2B-siRNA 复合物在生理盐水重悬液中不会发生解离。对于福尔马 林所致的相急性痛， 所有 组间的急性期伤害性反应无差别(P0.05)；而与 HG
4、组、HA 组、 NS 组和 BC 组相比，HN 组 和 PN 组对于福尔马林所致的相持续痛的伤害性反应显著减少（P0.05）， HN 组和 PN 组组间差异无统计学意义(P0.05)，对照组之间差异无显著性(P0.05)。脊髓免疫组织化学染色显示，HN 组、PN 组、HG 组、HA 组、NS 组和 BC 组各组脊髓 背角 NR2B 阳性细胞数分别为53.7911.38，60.639.9，99.0416.39，91.4214.39，101.2116.82，96.3810.27。与 HG 组、HA 组、NS 组、BC 组相比，HN 组和 PN 组脊髓背角 NR2B 阳性细 胞数明显减少（P0.05
5、），HN 组和 PN组组间差异无统计学意义(P0.05)，对照组之间差异无显著性(P0.05)。结论 1. 作为一种新的 siRNA 载体，羟基磷灰石纳米颗粒（HA）鞘内注射能有效转染NR2B-siRNA，减少福 尔马林致痛小鼠相痛行为；2. HA/NR2B-siRNA 复合物鞘内注射后能有效抑制小鼠脊髓背角 NR2B 的表达。脊髓背角 NR2B 与慢性病理性疼痛的关系及机制探讨1361.湖南省肿瘤医院麻醉科 410013；2. 湘雅三医院麻醉科 410013）白 洁 1 黄 东 2 王明德 1 杨金凤 1目的 通过比较 NR2B 在癌性痛、慢性炎性痛及神经病理痛三种动物模型中脊髓背角的表达，
6、探讨脊髓 NR2B 在不同性质慢性疼痛中发生以及维持中的作用。方法 选用体重 约 18-20g 的成年雄性 C57BL/6 小鼠 35 只，随机分为七组，正常对照组（C组， 5 只）：不予任何处理；慢性炎性痛组（F1 组， 5 只）：左脚掌皮下注射弗氏佐 剂 20l；炎性痛对照组（F2 组，5 只）：左脚掌皮下注射生理盐水 20l；神经病理痛组（N1 组，5 只）：暴露出坐骨神经干,用 5 - 0 铬制肠线环绕神 经干分别做 4 个轻度结扎环；神经 病理痛对照组（N2 组，5 只）：暴露出坐骨神经干，然后直接缝合肌肉皮肤；骨癌痛组（T1 组， 5 只） ：接种 Lewis 肺癌细胞 2106
7、个；骨癌痛对照组（T2 组，5 只）：接种等容 积的 PBS 液。 术后第七日开始，隔日观察小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛。建立小鼠疼痛模型后第 15 天，取癌痛 组小鼠左股骨分别作苏木素- 伊红（HE）染色 观察骨质破坏情况，并取各组小鼠腰段脊髓行 NR2B 免疫组化检测。结果 1 慢性炎性痛、神经病理痛、骨癌痛模型建立后第七天，都出 现明显自发痛行为，且持续整个观察期内；骨癌痛组于建模后的第 11 天起出现明显触 诱发痛，表现为术侧 50%缩足阈值明显下降，神经病理痛和慢性炎性痛组于建模后 7 天(即观察的第一天)就测到有明显触诱发痛，表现为术侧 50%缩足阈值明显 下降，持 续整个观
8、察期；骨癌痛组股骨 HE 染色示骨髓腔内大量肿瘤细胞侵润。2 脊髓背角 NR2B 免疫组化检查结果：慢性炎性痛组灰度值为有 58.924.61，与炎性对照组和正常组相比均有显著差异(P0.05) ；各对照组与正常组相比无明显差异(P0.05)。结论 在 C57BL/6 小鼠上，三种疼痛模型都 产生了明显的自 发痛和触诱发痛，且在慢性炎性痛、神经病理痛、骨癌痛模型中小鼠脊髓背角 NR2B 表达都增高，其中后两者较前者更甚，说明脊髓背角 NR2B 在慢性疼痛的产生和维持中起重要作用，但在不同模型所起作用并不完全相同。鞘内连续注射 DREAM-shRNA 对 CCI大鼠痛觉过敏的影响中南大学湘雅医院
9、麻醉医学系 137程智刚 于 鹏 王云姣 李靖怡 郭曲练 鄢建勤国家自然科学基金（30872427）和湖南省自然科学基金（ 05JJ40136）资助课题目的 探讨慢病毒介导的 siRNA 沉默 DREAM 对坐骨神经慢性压迫(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)大鼠痛觉过敏的影响。方法 选择健康雄性 SD 大鼠 24 只，随机分 为 4 组(n=6)：即 RNAi 组(试验组)、NS 组(生理盐水组) 、blank vector 组(空白 载体组) 和 sham 组(假手术组), 分别于造模前 1d(T0)、CCI 后第
10、7-14d(即 T7-T14)，每天测定痛阈( 包括 PWTL 和 PWMT)1 次。于 CCI 后第 8 天(T8)开始经微导管分别注入 pKCSHR-Puro/GFP- DREAM 慢病毒(110 9 IU/ml) 5l+NS 5l 或 blank vector 5l+NS5l 或 NS10l，连续注射 7d。于 CCI 后第 15d，取 L4-5 脊髓 节段，石蜡包埋、切片，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)。结果 1.痛阈的变化:各组基础 痛阈比较无统计学意义(p0.05); PWTL: 左后肢 PWTL: RNAi组的 T7-T10 及 T12、sham 组的 T7-T10、b
11、lank vector 组及 NS 组的 T7-T14 均低于基础痛阈(P0.05)。PWMT：左后肢 PWMT：各组 T7-T14 均低于基础痛阈(P0.05) 。2. 脊髓背角 GFP 表达：CCI 后 14d 时, RNAi 组脊髓背角神经细胞中 GFP 表达阳性, 其余三组无 GFP 的表达。结论 连续鞘内注射 pKCSHR-Puro/ GFP- DREAM 慢病毒 可以明显改善 CCI 大鼠的疼觉过敏现象。NR2B 在骨癌痛小鼠脊髓背角和背根神经节中的表达及意义中南大学湘雅三医院麻醉科 韩 睿 黄 东138目的 通 过观察骨癌痛小鼠疼痛行为学变化和脊髓背角与背根神经节 NR2B 受体
12、表达情况，以及它们之间的相关性，探讨 NMDA 受体 2B 亚型 NR2B 在癌性痛产生和维持中的作用。方法 选用体重约 16-18g 的成年雄性 C57BL/6 小鼠 45 只，随机分为三组，模型 组（15 只）：于小鼠股骨远端骨髓腔内接种 Lewis 肺癌细胞 2106 个；假手术组组（15 只）：接种等容积的 D-HANKS 液；正常对照组（15 只）：不予任何处理。接种容积 均为 10ul。术后 3 天始隔日观察小鼠自发痛行为及测定机械性触诱发痛和模型组肿瘤接种部位生长 增大水平。术后第 7、15、23 天，分别在戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉下， 4%多聚甲醛经心脏 灌注后，取各
13、组任选 5 只小鼠术侧后肢，分别作苏木素-伊红（HE）染色观察骨质破坏情况；取腰段脊髓膨大（L2-L4）和 L4 背根神经节（DRG）行 NR2B 免疫组化检测；取肿瘤侵犯组织和转移组织行苏木素-伊红（HE ）染色观察肿瘤对小鼠其他组织的破坏情况。结果 1）行为学结果：模型组接种后第 7 天左右出现自发痛行为，表现为接种侧后肢跛行、添足、自发抬足时间延长，出现轻微触诱发痛， 术侧行走后足评 分降低，并且伴有肿瘤接种部位组织增大呈黄豆大小；接种后第 15 天左右除了有自发痛现象外 还出现明显的触诱发痛，表现为机械缩足阈值明显下降，且持 续整个观察期，术侧行走后足 评分进一步下降，肿瘤接种部位组织
14、进一步增大呈蚕豆大小。接种后第 23 天小鼠肿瘤接种部位 组织增大呈鸽子蛋大小，活 动能力下降，托拽后肢行走。后肢组织 学于 7、15、23 天可见肿瘤细 胞部分或全部充 满骨髓腔，并随 时间延长逐渐穿破骨皮质向外生长，侵犯周围肌肉组织。模型组 23 天小鼠 5 只中有 4 只出现肿瘤向肺部、肾脏的转移，并以组织学证实。2）脊髓和 L4 DRG NR2B 免疫组化测定结果：模型组术侧 脊髓 NR2B 染色 7 天、15 天和 23天免疫反应阳性指数分别为 3.81.48、5.61.19、5.641.04，假手 术组分别为1.600.55、1.750.79、1.80.84，正常组分别为 1.66
15、0.41、1.640.40、1.600.44；模型组术侧 L4 DRG NR2B 染色 7 天、15 天和 23 天免疫反应阳性指数分 别为 4.601.34、9.602.51、10.22.58，假手术组分别为 2.01.22、1.801.10、2.01.22，正常组分 别为 2.11.52、1.801.10、1.901.24。分别与假手术组和正常组相比均有统计学差异(P0.05)；模型组 中术侧 7 天与 15 天， 7 天与 23 天比较差异有统计学意义（p0.05）。各组小鼠术后第 23 天 术侧脊髓背角 NR2B 免疫反应阳性指数与小鼠术侧后爪累计抬足时间明显正相关，r=0.976,P
16、0.05）结论 硬膜外联合应用布托啡诺可以用于无痛分娩。布托啡诺可以加快罗派卡因的起效和作用时间，能增加孕妇活跃期的 镇静效果，并且不影响新生儿 Apgar 评分。神经病理性疼痛大鼠脊髓蛋白质组双向电泳图谱的建立与初步分析1中 南 大 学 湘 雅 医 院 麻 醉 医 学 系 ，2中 南 大 学 湘 雅 医 院 卫 生 部 肿 瘤 蛋 白 质 组 学 重 点 实 验 室邹望远 1，郭曲 练 1，李茂玉 2，宋宗斌 1，张 重 2，赵 媛 2，程智 刚 1目的 建立神经病理性疼痛大鼠腰段脊髓组织蛋白质组双向凝胶电泳图谱，初步观察神经病理性疼痛大鼠腰段脊髓组织中蛋白质组的变化和差异表达。方法 慢性神
17、经病理性疼痛大鼠和正常对照组大鼠腰段脊髓组织蛋白以固相 pH 梯度等电聚焦（IEF）为第一向，SDS-PAGE 垂直电泳为第二向进行双向电泳（2-DE），应用图像分析软件对银离子染色的 2-DE 图谱进行图像分析，观察其差异表达。结果 大鼠腰段脊髓组织双向电泳图谱中的各个蛋白质点分离清晰，无明显的横向及纵向拖尾； 2-DE 图谱 中分离出明显差异表达的蛋白 23 个，其中 16 个蛋白表达显著上调，7 个蛋白表达显著下调。 结论 初步建立了一种较为理想的大鼠脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱，并发现了相当数量的差异表达蛋白质点，为慢性神 经病理性疼痛蛋白质组 学研究筛选神经病理性疼痛分子靶打下基础。
18、鞘内注射加巴喷丁和吗啡对切口痛大鼠脊髓氨基酸含量的影响湖南省桃源县人民医院麻醉危重医学科 胡兴国徐 州 医 学 院 江 苏 省 麻 醉 医 学 研 究 所 邹 功 胜 孔 明 刘 艳 阳 范 素 贞 曾 因 明142目的 在大鼠切口痛模型中研究鞘内注射（IT）加巴喷丁和吗啡对脊髓氨基酸含量的影响。方法 选择鞘内置管成功的雄性 SD 大鼠 40 只，随机分 为 5 组，每 组 8 只，分别为假手术组，对照组，加巴喷丁 50g 组 ，吗啡 2.5g 组，加巴 喷丁 50g 加吗啡 2.5g 组。按 Yaksh 法鞘内置管，按 Brennan 法制作大鼠足底切口疼痛模型， 用机械缩爪反射阈值（MWT
19、）和热缩爪潜伏期（TWL）观察疼痛行为学变化； 应用高效液相色谱法(HPLC) 测定脊髓谷氨基酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）、甘氨酸（ Gly）、-氨基丁酸 (GABA)含量的变化。结果 术前 it 加巴喷丁 50g 和吗啡 2.5g 在术后 2h 的 MWT 明显增大，TWL 明显延长（P0.05)；与 NS 组比较, T1 组降低 T 淋巴细胞增殖水平(P 0.05)；与 NS组比较，T1 ，T2，T3 组 NK 细 胞活性均无统计学意义( P0.05)；与 NS 组比较， T1 组 CD3+、 CD3+CD4+数量及百分率降低，CD4 +/ CD8+降低，差异有统计 学意 义 (P0.05)。结论 鞘内泵入较大镇痛剂量的曲马多(50g/h )降低大鼠 T 淋巴细胞增殖转化水平，改变T 淋巴细 胞亚群表型，对 NK 细胞活性和表型没有影响；一般 镇痛剂量曲马多（25g/h、12.5g/h）对机体免疫功能没有影响。神经根热凝射频毁损复合阿霉素注射治疗带状疱疹后遗神经痛的疗效研究中南大学湘雅医院麻醉医学系 任 飞 鄢建勤 程智刚 白念岳 杨胜辉目的 探讨胸椎旁 C 臂介入引导下神经根热凝射频毁损复合阿霉素注射治疗带状疱疹后遗
