1、基金项目：国家自然科学基金(31201627)；国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-A-01)； 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目作者介绍：肖纯梅，在读硕士研究生。研究方向：大白菜雄性不育育种。E-mail:。通信作者：孙日飞，博士，研究员，博士。研究方向：大白菜育种。E-mail: 大白菜细胞核复等位雄性不育的遗传分析及 基因定位肖纯梅，张慧，张淑江，李菲，章时蕃，孙日飞 *（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京，100081）摘要：以大白菜不育材料“939A”为母本，携带恢复基因的材料YDQ56A为父本构建隐性雄性不育分离群体F 1S4群体，利用混合分组分析法（BSA）对不
2、育基因初定位；同时以“939A”为母本， 携带保持基因的材料yellow sason为父本构建显性雄性不育F 2分离群体，对不育基因进行遗传分析及精细定位。结果在F 1S4群体中获得与不育基因连锁的标记2个，A08_1900和BrID111035,与不育基因分别相距8.8cM和2.5cM，物理距离为804.1kb；F 2群体中不育对可育为显性，不育单株与可育单株分离比经卡方检验符合3:1，不育基因表现为显性。通过标记验证，F 2和F 1S4两个群体定位结果一致，均位于A08染色体末端，通过新标记的筛选并定位获得不育基因其两侧紧密连锁的标记Br19470306和Br19675586，与不育基因分
3、别相距1.6cM和2.4cM，物理距离205.28kb，其中包含58个基因。F 1S4和F 2两个群体定位结果一致，均位于A08染色体末端，该结果为大白菜雄性不育系的利用以及转育为下一步花粉发育相关基因筛选及功能验证奠定了基础。关键词：大白菜；雄性不育；花粉发育；基因定位GeneticFine Mapping of the Multi-allele Genic Male Sterility Gene in Brassica rapa L. ssp. pekinesisXIAO Chun-mei, ZHANG Hui, ZHANG Shu-jiang, LI Fei, ZHANG Shi-fan
4、, SUN Ri-fei(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)Abstract: Multi-allele Genic male sterility (GMS) is one of the most important methods for hybridization breeding in Chinese cabbage (Brassica B. rapa L. ssp. pekinensis). We developed a A segr
5、egating population F1S4 from a cross between a male sterile line 939A and a fertile line YQD56A which contained restoring gene was developed. Bulked segregate analysis (BSA) was used to screen markers linked to the MS gene. At the same time, we get got an an F2 population from a cross of 939A and a
6、fertile line named yellow sason which contained maintainer gene was received for the confirmation of the location and fine mapping of MS. Bulked segregate analysis (BSA) was used to screen markers linked to the MS gene. Finally we found 2 markers, A08_1900 and BrID111035, were found in F1S4 populati
7、on, were linked to MS. The distance was 8.8 cM and 2.5 cM, respectively. In F2 population, the MS were mapped in the same region in chromosome A08 with its in F1S4 population. Further, Br19470306 and Br19675586 were found tightly linked closely to MS. The distance was 1.6cM and 2.4cM, respectively.,
8、 In this region,including 58 genes in itthis region were found. The location where we mapped MS was consistent in these two populations, which was in the end of linkage group A08. These results can be used for finding the candidate gene of MS and then accelerate breeding programs.Key words: Brassica
9、 rapa L. ssp. pekinensis; male sterility; anther development; gene mapping大白菜（Brassica B. rapa L. ssp. pekinensis ） 是我国重要的蔬菜作物，存在显著的杂种优势，雄性不育系是育种杂种一代种子生产中应用的主要手段之一。我国对十字花科蔬菜雄性不育遗传机理的研究起始于20世纪中期理论模型主要有：单基因隐性雄性不育 1，单基因显性+ 微效基因调控的甘蓝雄性不育遗传模式2，双基因互作雄性不育 3及复等位基因雄性不育 4等。其中， 。钮心恪等提出单基因隐性雄性不育遗传模式，利用雄性不育两用系生产
10、大白菜杂交种，降低了生产成本，克服了原种生活力易退化等困难。方智远1等提出单基因显性+微效基因调控的甘蓝雄性不育遗传模式，配制 获得了不育率接近100% 的雄性不育系。张书芳 2提出双基因互作显性上位作用，由此配制出了100%的雄性不育系，魏毓棠提出细胞核主效基因显性抑制及微效基因修饰的遗传模式，这与双基因互作显性上位有许多相似之处，都认为不育为显性，且都将不育性归结于两对主效基因的互作。在此基础上，冯辉等 4提出的大白菜复等位基因雄性不育遗传模式认为， 。该位点有三个等位基因即恢复基因（Ms f） 、不育基因（Ms ） 、保持基因（ ms） ，三个基因的显隐性关系为Ms fMsms。该模式建
11、立了乙型系（显性雄性不育系）和甲型系（隐性雄性不育系） ，利用隐性雄性不育乙型系中的不育株与显性雄性不育系甲型系中的可育株杂交，获得100%雄性不育系。该理论的提出为雄性不育的利用开辟了一条新途径。 ，因此，对该遗传模式遗传机理及不育基因的克隆研究尤为重要，可以为实践生产提供理论支持。以复等位基因雄性不育遗传模式为基础提出的转育模式已成功应用于白菜品种选育上并成功选育出卵圆生态型大白菜核基因雄性不育系 5。但是利用该模式在转育过程中，通过表型进行基因型判定十分复杂且周期长。利用分子标记进行辅助选择（MAS）可加快选育速度。分子标记与基因的距离是制约其准确性的关键因素之一，选择紧密连锁的标记或基
12、因内部的标记是成功应用MAS的前提 6 -8。Miao等 7开发4个与隐性雄性不育基因连锁的STS标记；Ying等 8找到4个与小白菜细胞核隐性雄性不育恢复基因连锁的AFLP标记，并成功转化为STS 标记；沈向群等 9筛选到一个与大白菜育性恢复基因连锁的RAPD标记；张淑江等 10找到了一个与细胞核显性雄性不育连锁的RAPD 标记，并成功转化为SCAR 标记，遗传距离2.61cM；冯辉等筛选到2个位于不育基因 Ms同一侧的SSR标记，最近遗传距离4.95cM；袁鹤等 11利用初级三体获得一个距离不育基因1.2cM的AFLP 标记，将雄性不育基因定位在A04染色体的着丝粒附近；刘志勇、冯辉等 1
13、2采用 BSA法获得与大白菜雄性不育基因M S连锁的 3个AFLP 标记，并将其转化为SCAR 标记，最近遗传距离为1.60cM；张慧等 13利用SRAP-AFLP标记技术，筛选到与恢复基因连锁的2个SRAP标记，最近遗传距离2.98cM，并将该基因定位于 A08染色体上；2011 年（补充作者）对一隐性雄性不育系的恢复基因进行SRAP标记，筛选到2个连锁标记，最近遗传距离4.35cM，并将该基因定位于大白菜A07染色体着丝粒附近。 （该段落把不育基因和恢复基因混在一起描述，层次不清晰，语言不够简洁） 。通过前人的研究，已获得多个与育性基因连锁的标记如表1。其中，张慧等 1516于大白菜不育材
14、料“939A”中发现一新的位于 A08染色体上的雄性不育位点，与 15个大白菜高代自交系杂交结果表明，该位点属于复等位雄性不育类型，并找到了一个SRAP标记，将该基因定位于A08 染色体上。 。但目前多采用一、二代分子标记（AFLP、RFLP、RAPD、SSR ） ，缺乏精细定位结果及候选基因的分析。因此有必要继续开展大白菜雄性不育基因的定位研究，为分子标记辅助育种奠定基础。本试验在张慧等 1516研究的基础上，利用该不育材料构建F 2代群体，通过分析验证不育基因的遗传规律，BSA法筛选InDel 及SSR标记精细定位该不育基因，并对候选基因进行初步筛选，为该不育基因的克隆及其参与的花粉发育机
15、理研究及大白菜雄性不育生产利用奠定基础。表 1 与大白菜育性连锁的标记Table 1 Markers linked to sterility gens 1 材料与方法1.1 试验材料供试材料939A是由田间育性突变材料 构建的？选育的大白菜雄性不育系。以此不育材料为母本，构建了分离群体。群体选用张慧等 15构建的F 1S4群体；群体 以印度油用型白菜yellow sarson 为父本，939A为母本，杂交后F 1代自交，构建包含297个单株的F 2分离群体。所有群体单株定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京顺义试验田。1.2 表型调查在大白菜开花期对F 2代单株育性进行调查，主要包括始花期、盛
16、花期、开花末期三个阶段，每阶段重复调查3次，每次相隔1天。观察花瓣、花药、花丝的形态及花粉有无并据此综合判断育性。1.3 显微镜观察花药内部微观结构及花粉活性大白菜花期上午8-10时采集当天开放的花药。取少量花粉于载玻片上，加上1-2 滴1%的醋酸洋红溶液，盖上盖玻片。将载玻片置于显微镜下观察3-5片，每片选择 3-5个视野。1.4 DNA提取及分离群体分组分析（BSA）采集白菜群体单株幼嫩叶片，冷冻抽干后，采用改良CTAB法 17提取植物全基因组DNA，利用Nanodrop检测浓度及质量。在群体、群体中分别选取10株不育株及可育株，利用Nanodrop将建池单株的DNA 浓度稀释至50ng.
17、uL-1。 采用分离群体分组分析（BSA ）法等量混合不育株和可育株 DNA，构建不育基因池（S）和可育基因池（F） ，用于分离群体分组分析。1.5 不育基因连锁标记筛选及基因定位不育基因定位共利用265对InDel和28对SSR标记，其中两个群体初定位的28对SSR和220对InDel 标记引物序列由BRAD （http:/brassicadb.org/brad/）网站获得。45对精细定位InDel引物根据40份白菜重测序序列，利用Primer5软件，在白菜A08 染色体末端初定位区域特异设计。所有标记引物序列由生工北京公司合成。PCR反应体系为10uL，其中包括 10PCR缓冲液，0.25
18、mmol/LdNTPs，1.0umol/L 上下游引物，50ng/uL模板DNA ，1U Taq 。 PCR循环程序为：94变性5min，94 变性40s，55退火40s，72延伸50s，35个循环。PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。筛选出的多态性标记分别在群体 和群体中检测，雄性不育类型Materials定位基因Genes标记类型makers最近遗传距离Genetic distance参考文献Reference 隐性雄性不育显性雄性不育复等位基因雄性不育不育基因 gms不育基因 ms不育基因恢复基因 MSf不育基因 Ms不育基因 Ms恢复基因 BrMsf3恢复基因 BrMf2ST
19、SAFLPSCARRAPDSSRSCARSRAPSRAP 1cM1.2 cM2.61 cM4.95 cM1.60 cM4.35cM(A07 染色体)2.98cM(A08 染色体)Miao Y9,2003袁鹤等 10，2009张淑江等 11，2008沈向群等 12，2005冯辉等 13，2009刘志勇等 14，2010张慧等 15，2011张慧等 16，2010统计标记多态性，利用JoinMap4.0软件进行连锁分析。1.6 候选区域基因的筛选利用白菜基因组序列信息以及注释信息（BRAD， http:/brassicadb.org/brad/） ，辅以TAIR及KEGG2数据库信息，对定位区域进
20、行候选基因预测和分析，寻找影响大白菜花粉发育过程的相关基因。2 结果与分析2.1 花药内部微观结构及花粉活性检测育性调查发现F 1代育性性状调查不稳定，受环境影响，表现为在始花期、盛花期无花粉，但在开花末期却有少量花粉出现。通过显微镜观察验证部分该花粉具有活性。F 2代单株中，可育单株在始花期、盛花期、开花末期均有花粉；不育单株可分为两种情况：单株在始花期、盛花期、开花末期均无花粉表型与F 1代相似。显微镜观察花药压片显示（如图1） ，F 1代开花末期出现微量花粉的单株，其少部分花粉有活性，部分花粉形态畸形。F 2代不育株花药干瘪，内部椭圆形的花粉粒很少，染色后颜色浅红，个别花药中有成熟花粉粒
21、，但其形态畸形无活性；可育株花药饱满，内部被椭圆形花粉充满，染色后颜色深红并有明显的散粉现象，显微镜观察单个花粉发现，可育花粉椭圆形，深红色，活性良好。通过以上调查和检测，最终确定F2代中得到可育株83株，不育株214株。2.21 大白菜雄性不育遗传规律分析通过前期遗传学分析 15，本研究中的雄性不育基因符合复等位遗传假说。群体中，育性分离比率符合3:1，不育基因表现为隐性。群体 中，939A不育株与yellow sarson杂交，F 1代表现不育，说明yellow sarson育性基因型为保持基因 msms（图1） 。但盛花期后F 1代部分单株表现环境敏感，出现微量花粉，利用微量花粉，进行F
22、 1代自交，获得F 2代297个单株，其中83株为可育株，214株为不育株，育性表现为1:3分离（ 2=1.374920.05=3.84） ，证明F 1代基因型为Msms 。 ， 表现为不育但在该群体中育性受环境影响。Ms为不育基因， ms为育性保持基因Ms is the male sterile gene and ms is the maintained sterility gene图21 大白菜细胞核显性雄性不育系遗传模式Fig.21 tThe genetic model inheritance pattern of dDominant genic male sterile gene2.2
23、 花药内部微观结构及花粉活性检测显微镜观察花药压片显示（如图2） ，不育株花药干瘪，内部椭圆形的花粉粒很少，染色后颜色浅红，个别花药中有成熟花粉粒，但其形态畸形无活性；可育株花药饱满，内部被椭圆形花粉充满，染色后颜色深红并有明显的散粉现象，显微镜观察单个花粉发现，可育花粉椭圆形，深红色，活性良好。F 1代有活性花粉量介于可育株与不育株之间，染色后发现部分花粉形态畸形。aa2.3 大白菜雄性不育基因定位经BSA在群体 不育池及可育池间共筛选了88对InDel引物，发现3对InDel （BrID111035、A08_1875及A08_1900 ）在两池及建池单株间表现出多态性。用 3对InDel标
24、记检测F 1S4群体的145个单株，利用Joinmap4.0分析其连锁关系发现，这3个InDel 标记分别位于不育基因两侧，距离不育基因2.5 cM 、8.8 cM、14.2cM 。通过这3个InDel标记的序列比对，将不育基因定位于A08染色体末端，与其紧密连锁的标记为BrID111035、 A08_1900，两标记间的遗传距离为11.3cM，物理距离为804kb。A-C:不育株花药压片、醋酸洋红染色后内部结构和花粉数及花粉活性 D-F:可育株花药压片、醋酸洋红染色后内部结构和花粉数及花粉活性 G-I: F1代环境敏感型单株盛花期后花药压片、醋酸洋红染色后内部结构和花粉数及花粉活性A-C:
25、pollen number and activity in sterile individual D-F: pollen number and activity in fertile individual G-I: pollen number and activity in F1 later flowering stage.图 12 不育株和可育株花粉活性鉴定Fig.12 pollen activity identification in sterile and fertile plant群体中有多态的三对标记在群体中验证均没有多态性，根据大白菜不育基因Ms的初定位结果，在群体的不育池及可育池
26、间共筛选位于A08 染色体上的149 对InDel 引物和28对SSR引物，其中21对InDel 引物及2对SSR引物表现出多态性。经建池单株验证后发现， 6个InDel 标记（BrID981、BrID991、BrID997、Br11005、Br19747979、Br20023450）及2个SSR标记（SSR 881185、SSR60514）在建池单株间表现出良好的多态性。用这 8对多态性标记检测F 2群体的297个单株，利用Joinmap4.0分析其连锁关系，发现这8个标记与不育基因Ms紧密连锁，距离最近的两侧标记为SSR60514及Br19747979，通过序列比对，该区间位于群体定位的两
27、端标记BrID111035、A08_1900 之间（图3） ，群体和群体定位结果一致。表21 大白菜雄性不育基因连锁的特异InDel标记?Table 21 specific InDel markers from male sterile group of Chinese cabbagelinked to male sterility geneInDel标记InDel marker物理位置/bpPhysical location5引物序列5primer sequence3引物序列3primer sequenceBrID981 17970182 TCTTTTGGATCGATGTAGGT CAACT
28、TGTTGATGTTGATCGBrID991 18587783 GGACGTGAAGCAAATACAAT ACAAGAAGCTGGAAGTCAAAfa bd ega bg hA B CD E FG H IBrID997 18737284 CCCAGAAGATTACTGTTTCG ATCCTCTTCGTCTTCCTAGCBr11005 18846874 CTCTCTGCTCCAATATGGTT TGCACTGCTTATGTGATGTTSSR881185 18881185 GTGACTCTTGGAGGGTGAGC TTTTGATCGCTTGGTGTTTGATSSR60514 19360514 GC
29、GAGATTGATCTCTGACCACAGCGTAGGCTCCTCGACATACBr19193199 19193199 GTATGTGCAAGATCGACTCC CGACAGCTAAAATTCAGGTTBr19470306 19470306 CGTATGTTTATGTCTACCCACA TCAGATCCGAAATACAAACCBr19675586 19675586 ACGGATCTATGAATTTGTGG TGCACTCAATGCTTAGCTAGTBr19747979 19747979 ATTTGTGCATAAAGTGGGAC GGGGGAGGTTTATAGTAGTTTTBr20023450
30、20023450 CTTGATATCGGTTTCTTTGC TGGGAGTCAAAGATCAATGT利用初定位结果，参考大白菜基因组序列分析，在标记SSR60514 及Br19747979之间，设计33对InDel标记，找到其中3个标记位于SSR60514及Br19747979标记内部。通过遗传连锁分析，不育基因两侧紧密连锁的分子标记为Br19470306和Br19675586，遗传连锁距离分别为1.6cM和2.4cM ，两标记间物理距离为205.28kb（图3） 。Ms为不育基因， Br19470306和Br19675586为不育基因两侧最近的标记Br19470306 and Br19675
31、586 were the two flanking markers of the male sterile gene(Ms)图3 大白菜雄性不育基因遗传连锁图谱Fig.3 Genetic map of Male sterile gene (Ms) in Brassica rapa.2.4 大白菜雄性不育基因候选区域的？筛选确定通过白菜基因组序列信息，发现精细该定位区域的205kb范围内共内有58个候选基因。根据基因组注释信息，结合TAIR和KEGE G2数据库信息，该58个基因中未知功能基因7个，已知功能基因49个，其中可能影响花粉发育的基因有：糖代谢相关酶类8个、细胞凋亡及信号转导相关基因5
32、个、转录因子5个，茉莉酸合成相关基因2个，纤维素合成相关基因1个（表32） 。表32 定位区域内的大白菜基因及拟南芥同源基因Table 32 Brassica rapa genes in positional region and the homologous genes in Arabidopsis thaliana in predicted region大白菜基因编号Brassica rapa gene拟南芥基因编号Arabidopsis thaliana gene基因注释信息Annotations informationBra016839 AT1G11330 植物凝集素蛋白激酶家族 le
33、ctin protein kinase family proteinBra016840、Bra016841 AT1G11310 MLO2霜霉病抗性基因，钙调蛋白 calmodulin bindingBra016842 AT1G11300 ATP结合蛋白 ATP bindingBra016843 AT4G38940 F-box蛋白家族 F-box family proteinBra016844 AT1G61360 植物凝集素蛋白激酶家族 lectin protein kinase family proteinBra016845 AT2G40920 F-box蛋白家族 F-box family p
34、roteinBra016846 AT1G11250 突触融合蛋白SYP125 SYNTAXIN OF PLANTS 125Bra016847 AT1G11240 功能未知 unknownBra016848 AT1G11200 功能未知 unknownBra016849 AT1G11190 限制性内切酶BFN1Bra016850 AT2G39280 RAB家族GTP酶 RAB GTPase activatorBra016851 AT1G11170 功能未知 unknownBra016852 AT1G11120 功能未知 unknownBra030762 AT1G09195 磷酸二酯键水解酶 Pp
35、x/GppA phosphataseBra030763 AT1G09210 钙调蛋白 CRT2Bra030764 AT1G09220 PPR蛋白家族 Pentatricopeptide repeat (PPR) super family proteinBra030765 AT1G09270 运输蛋白 异构体 IMPA-4Bra030766 AT1G09290 功能未知 unknownBra030767 AT1G09300 金属肽酶M24家族 metallopeptidase M24 family proteinBra030768 AT1G09310 功能未知 unknownBra030769
36、AT1G09330 功能未知 unknownBra030770 AT1G05080 F-box蛋白家族 F-box family proteinBra030771 AT1G09270 运输蛋白 异构体 IMPA-4Bra030772 AT1G05080 F-box蛋白家族 F-box family proteinBra030773 AT1G09400 12-氧代植物二烯酸还原酶 12-oxophytodienoate reductaseBra030774 AT1G76680 12-氧代植物二烯酸还原酶 1 OPR1Bra030775 AT1G09420 葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶4 G6PD4B
37、ra030777 AT1G09430 柠檬酸合成酶 ACLA-3Bra030778 AT4G10780 抗病蛋白 CC-NBS-LRR disease resistance proteinBra030779 AT1G12280 抗病蛋白 CC-NBS-LRR disease resistance proteinBra030780 AT1G09460 1,3-糖苷酶 glucan endo-1,3-beta-glucosidase-relatedBra030781 AT1G09520 PHD锌指蛋白 zinc ion bindingBra030782 AT1G09520 PHD锌指蛋白 zinc
38、 ion bindingBra030783 AT1G09540 转录因子MYB61Bra030784 AT1G09550 胶质乙酰酯酶 pectinacetylesteraseBra030785 AT1G09560 类萌蛋白5 GLP5Bra030786 AT1G09580 emp24/gp25L/p24蛋白家族Bra030787 AT1G09690 60S核糖体蛋白L21 RPL21CBra030788 AT1G09600 蛋白激酶 protein kinase family proteinBra030789 AT1G09610 未知功能蛋白 unknown proteinBra030790
39、 AT1G57720 延伸因子 eEF-1B gammaBra030791 AT1G09660 RNA结合蛋白QK quaking proteinBra030792 AT1G09690 60S核糖体蛋白 60S ribosomal protein L21Bra030793 AT1G09700 miRNA加工蛋白HYL1Bra030794 AT1G09730 半胱氨酸蛋白水解酶家族 Ulp1 protease family proteinBra030795 AT1G09740 类腺嘌呤 核苷酸水解酶Bra030796 AT1G09750 DNA结合蛋白Bra030797 AT1G09760 核糖
40、核蛋白A U2ABra030798 AT1G09770 MYB转录因子ATCDC5Bra030799 AT1G09780 2,3-二磷酸甘油酸异构酶 2,3-biphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutaseBra030800 AT1G09790 纤维素合成调控基因COBL6Bra030801 AT1G09812 未知功能蛋白 unknown proteinBra030802 AT1G09830 磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶PUR2 phosphoribosylamine-glycine ligaseBra030803 AT1G09840
41、SHAGGY-LIKE蛋白激酶 ATSK41Bra030804 AT1G09880 裂解酶 lyaseBra030805 AT1G09920 TRAF类锌指蛋白Bra030806 AT1G09932 二磷酸甘油酸异构酶3 讨论3.1 大白菜雄性不育遗传分析本试验以939A不育系中的不育株 和与其亲缘关系较远的印度油用型白菜yellow sarson 杂交，F 1代为环境敏感型，具体表现为：始花期表现不育，花药短小扁薄，颜色浅白；开花中期和开花后期，随着温度升高，其侧枝开花，产生微量花粉，花粉活力鉴定为有活性。F 2代群体符合单基因显性遗传规律，其中亦出现环境敏感型单株，但其受环境影响的程度较F
42、 1代明显降低。张慧 15利用939A 不育源与15个不同生态型的大白菜高代自交s系杂交，11个自交系与939A杂交后代表现全可育，4个自交系与939A 杂交后代表现全不育，并没有环境敏感型单株出现。据此同样的，环境敏感型雄性不育在水稻中也有报道。1973年，石明松发现“湖北光敏核不育水稻”，各地的育种工作者也对其基因进行遗传模式研究及定位。梅国志等认为，光敏不育是由光敏基因与育性差异基因协同作用，并提出了修饰基因强烈影响光敏雄性不育后代表型的报告。据此推测本试验群体环境敏感型单株出现的原因：该基因在不同的遗传背景下表现为环境敏感和环境稳定两种类型。该雄性不育受一对主效基因控制但有微效基因起调
43、控作用。环境敏感型雄性不育在小麦 18、水稻 19 20及十字花科其他作物中都有见报道。张建奎 16通过观察温光敏核雄性不育小麦减数分裂及小孢子发育过程发现低温短日照下小孢子发育在单核靠边期停滞，而在高温长日照下可形成正常可育的三核花粉粒，与本试验结果相似。方智远 2等在于一甘蓝显性雄性不育系中发现环境敏感型的显性雄性不育单株，通过自交可以获得显性纯和的雄性不育单株，利用这一遗传特点建立了显性雄性不育基因配制甘蓝杂交种的新方法。本试验群体环境敏感型单株的出现与甘蓝显性雄性不育表现极其相似，因此，在利用复等位雄性不育转育模式的同时也可以参考甘蓝显性雄性不育配种方法，选择经济性状优良的环境敏感型不
44、育株连续自交，最终获得环境稳定的不育株。针对此种情况，实际生产中可选择经济性状优良的环境敏感型不育株连续自交，最终获得环境稳定的不育株？。同时，为了减少使用该不育材料时由于环境敏感带来的危险性，尚需要进一步研究环境的各因素与不育基因的具体量化关系？，而且为了避免环境敏感型单株的出现，还需要进一步的研究环境敏感基因的遗传行为。3.2 大白菜雄性不育基因定位本试验利用同一不育源做母本分别构建了隐性和显性雄性不育分离群体，对一细胞核复等位雄性不育基因进行定位，结果发现两个群体的定位区域一致，位于A08染色体末端，与前人定位的A07 12和A04 8染色体着丝粒附近结果不一致，说明该不育基因为一新型雄
45、性不育复等位基因，丰富了雄性不育研究内容。本试验利用重测序材料基因组信息设计InDel标记，具有操作简单，特异性强，准确度高等特点；两侧标记到和不育基因的最近遗传距离1.6cM，两标记间物理距离205.28kb，较前人的定位结果更近且可以利用标记将定位区域比对到大白菜基因组，为下一步基因筛选及功能验证打下基础。3.3 雄性不育基因候选区域的确定筛选花粉发育本身是一个极其复杂的过程，涉及不同的调控及代谢途径，例如花粉发育基因、细胞壁形成、细胞信号转导、细胞程序性死亡、能量代谢、转录因子调控等 21-23。目前在植物中已经克隆验证很多雄性不育基因，如拟南芥中SPL、AMS、DYT1、EMS1等 2
46、324花粉发育特异基因及bHLH、MYB、MADS等2325转录因子家族。大白菜中通过反向遗传学鉴定的雄性不育相关基因有BcMF1、BcMF3、BcMF4 、BrLTP1、BrPME1等 2627。本试验定位区域内共有58个基因，其中可能涉及花粉发育调控过程的有：能量代谢、细胞凋亡及信号传导、转录因子、茉莉酸合成、纤维素合成等。其中有文献报道茉莉酸在调控拟南芥雄性器官正常发育过程中起重要作用，拟南芥茉莉酸合成型突变体及不敏感型突变体coil表现雄性不育 2829；MYB转录因子与靶基因结合可以导致水稻aid1 突变体花药不开裂，该种花药不开裂现象在拟南芥中也有报道 3031； Raj Chau
47、bal32在对玉米ms23和ms32两个突变体的研究中发现，纤维素合成与花粉壁形成及绒毡层分化异常有关，两者均可以导致花粉母细胞减数分裂过程异常，进而导致雄性不育。也有文献报道拟南芥中GSK家族中的AtSK11 及AtSK12 调控花发育，认为降低其转录水平可以加速花器官分生组织发育及雌蕊形成。ASK及ASK在花药中也有很高的表达量；Bra030803是拟南芥中ATSK基因(AT1G09840)的同源基因，是信号传导途径中的关键蛋白激酶，同时还参与细胞分化和组织形成等过程。据此推测Bra030803可能是Ms的候选基因之一。为找到该不育基因，还需要进一步的精细定位、候选基因筛选和后期功能验证。
48、参考文献1钮心恪 , 吴飞燕, 钟惠宏, 等. 大白菜雄性不育两用系的选育与利用J. 园艺学报, 1980, 7(1): 25-31.2方智远 , 孙培田. 甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用J. 园艺学报, 1997, 24(3): 249-254.3张书芳 , 宋兆华, 赵雪云. 大白菜细胞核基因互作雄性不育系选育及应用模式J. 园艺学报, 1990, 17(2): 117-125.4冯辉 , 魏毓棠, 许明 . 大白菜核基因雄性不育系遗传假说及其验证 CJ. 中国科研第二届青年学术年会园艺学论文集. 北京农业大学出版社, 1995, 485-466. 5岳艳玲 , 冯辉. 核基因雄性不育在
49、不同生态型大白菜间的转育J. 中国蔬菜, 2006 (7): 22-23.6Liu Bo, Wang Yan, Zhai Wei, Deng Jie, Wang Hui, Cui Yang, Cheng Feng, Wang xiaowu, Wu jian. 2013.Development of InDel markers for Brassica rapa based on whole-genome re-sequencingJ. Theoretical and Applied Genetics, 2013.126(1):231-239.7Mc Couch S R, Chen X, Panaud O, Temnykh S, Xu Y, Cho Y G, Huang N, Ishii T, Blair
