1、国家公益行业专项 201513002-05收稿日期-2018-01-26作者简介：鲁玉杰 女 1971 年 9 月出生 教授 粮食储藏与品质控制利用 DNA 分子指纹图谱技术检测小麦粉中害虫的研究鲁玉杰 袁园 刘凤杰 王争艳 何向楠（河南工业大学粮油食品学院， 河南省小麦储藏协同创新中心 ，郑州，450001）摘要 为开发快速检测我国成品粮中害虫的技术，研究了 DNA 分子指纹图谱技术检测小麦粉中主要害虫的碎片和虫卵的含量。结果表明，通过对害虫的延长因子 EF1 基因片段引物的筛选和 PCR 条件的选择，确定了有效地检测出来小麦粉中的赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗的成虫碎片、幼虫和卵通用引物和 P
2、CR 扩增条件。通过改良的 PCR 技术可在 4 h内快速检测杂拟谷盗、锯谷盗的卵、幼虫和成虫碎片。最低检出限为可检测出小麦粉中0.05%（ w/w）卵和幼虫、1% 成虫的碎片，灵敏度超过了国际标准。DNA 指纹图谱中电泳条带亮度（Y）与被检测的不同害虫碎片含量（X）成正相关，回归方程为Y=858.36X+74.540 相关系数 r 为 0.961 9。利用该技术检测随机取样的小麦粉中成虫的碎片，检测的准确率最高可达 80.56%。结果说明了利用 DNA 分子指纹图谱技术可快速检测出小麦粉中害虫的碎片、幼虫和卵含量，并可预测小麦粉中害虫的感染程度。本研究为开发快速小麦粉中害虫的快速检测技术具有
3、重要的参考意义。关键词 DNA 分子指纹图谱 害虫碎片 赤拟谷盗 杂拟谷盗 小麦粉 最低检测限中图分类号：TS201.6;Q969.98 文献标识码：A 文章编号：1003-0174（ ） - - DNA Molecular Fingerprint Pattern Technology to Detect Pests in Wheat FlourLu Yujie, Yuan Yuan, Fengjie Liu, Zhengyan Wang, Xiangnan He(School of Food Science and Technology，Henan University of Technol
4、ogy, Zhengzhou, Henan Province, 450001)2Abstract To develop the technology of fast detection of insect in our grain, the molecular fingerprint technique was used to detect quickly adults fragments and eggs of insect in wheat flour. The results showed that the universal primers and condition of PCR w
5、ere confirme that could be detected the adult fragments, larval and eggs of Tribolium castaneum ,T. confusum and Oryzaephilus surinamensis by selecting the primers for insect elongation factor gene EF1 and PCR condition. Improved PCR technology could quickly detect the eggs、larva and fragments of T.
6、 confusum and O. surinamensis in wheat flour in 4hours.The lowest detection limitation for eggs and larvae of wheat flour is 0.05% (w/w), for adult fragment is 1%(w/w). Sensitivity of detection exceeds the international standard. There was a positive correlation brightness of DNA agarose gel electro
7、phoresis banding (Y) and adult fragment content in flour(X) and the regression equation is Y=858.36X+74.540 (r= 0.9619). The highest prediction accuracy with DNA fingerprint technique to detect adult fragments within the random sampling of flour was 80.56%. Results showed that the DNA molecular fing
8、erprinting technology could be used to predict the infection degree of insect in wheat flour. Our research had significant value to explore the rapid detection technique for insect in wheat flour.Key words DNA molecular fingerprint pattern, Insect fragments, Tribolium castaneum, Tribolium confusum,
9、Wheat Flour, The lowest detection limit小麦粉中害虫碎片的数量是面粉质量等级的划分的重要指标。在国际贸易中销售的不同等级的小麦粉中害虫碎片的含量在各个国家有不同的规定，加拿大卫生保护组织规定每50 g小麦粉样品中含有少于20个大于0.2 mm的昆虫碎片 1。而美国食品和药物管理局规定禁售程度为每50 g小麦粉中含有75个或更多的昆虫碎片 2。在欧洲，对小麦粉中害虫碎片的量也有一些限制。近年来，夏季面粉厂最头疼的是面粉虫害问题 3。小麦粉生虫还严重影响面粉的质量和出口贸易 4。目前害虫数量的检测方法没有统一的标准。染色法 3、近红外光谱检测法 5、磷钨酸检测
10、尿酸法 6、浮选法 7、酶联免疫吸附测定法 8、高效液相色谱法 9等是近几年研究的热点，但目前还没有一种快速准确的方法并在实际中得到推广。DNA(脱氧核糖核酸) 是细胞染色体中的遗传基因，其分子各个片段就代表各个遗传信息 10。由于DNA 指纹图谱直接反映DNA水平上的差异，它成为当今应用广泛的遗传标记系统。目前，DNA 指纹技术在昆虫领域的应用主要集中在系统演化及分类鉴定两方面 11-12。Balasubramanian等 13利用DNA指纹技术能够检测小麦粉中赤拟谷盗和杂拟谷盗成虫的碎片，3其灵敏度为小麦粉中1.0%的害虫感染水平。本文为开发小麦粉中快速有效的检测害虫的技术，利用了昆虫的延
11、长因子基因EF1为目的基因的DNA分子指纹图谱技术对小麦粉中的常见的赤拟谷盗Tribolium castaneum、杂拟谷盗Tribolium confusum和锯谷盗Oryzaephilus surinamensis的碎片、幼虫和卵进行了检测，并抽取了面粉厂中样品对其幼虫含量进行了灵敏度和准确率的验证。1. 材料与方法1.1 供试材料1.1.1虫源试虫赤拟谷盗 Tribolium castaneum ，杂拟谷盗 Tribolium confusum 和锯谷盗 Oryzaephilus surinamensis 采自河南省郑州市，在河南工业大学储粮生态实验室培养数代后备用。选用虫龄、生理状态一
12、致的赤拟谷盗、杂拟谷盗、锯谷盗（成虫、幼虫和虫卵）。赤拟谷盗和杂拟谷盗的饲料为全麦粉：碎麦粒：酵母（9:3:1 ）；锯谷盗的饲料配比为：全麦粉：碎麦粒：燕麦片：酵母（5:3:3:1）。在温度（30 2），湿度（705）% 的培养箱中培养。1.1.2供试小麦粉选用无虫且品质较好的小麦，将其除去杂质后用自来水洗干净，放入烘箱中 60 烘（2 3）h，烘干，将小麦的水分含量调至（14 0.5）% 。将小麦取出冷却至室温，用实验室小麦磨粉机磨成小麦粉。小麦粉经过 80 目筛子，筛去大于 80 目筛孔的小麦粉或面团，筛下物即为所需的小麦粉样品。一部分小麦粉用于所需虫源的饲料，一部分作为 DNA 提取时所
13、需的小麦粉样品。1.2 方法 1.2.1 兼并引物设计以鞘翅目模式昆虫赤拟谷盗的延长因子（GB：HM156722.1 ；GI：299152241）基因序列为模板，在 NCBI 中找到赤拟谷盗的基因序列，找出其编码序列。将基因的编码序列在 NCBI 中进行 BLAST 比对，在比对结果中挑选不同的昆虫的序列。利用 Clustalx 软件选取出相同的基因序列，兼并引物的设计在 1822 个碱基，同一列不同的碱基用其他的字母代替，不同的引物组合如表 1 所示。41.2.2 不同的昆虫基因组的提取从赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗中提取的基因组，采用 Ezup 柱式动物基因组 DNA 抽提试剂盒（生工生物（
14、上海）有限公司生产）说明书，其方法步骤略。1.2.2PCR 反应条件不同昆虫 PCR 反应的条件按照梯度 PCR 进行条件的设定，然后得到一个确定的反应条件赤拟谷盗不同虫态的反应条件为：94 ，预变性 5 min；94 ，变性 30 s 和 56 退火 45 s； 72 延伸 30 s 的 35 个循环；72 ，延伸 10 min；16 保温 1 h 之内放入 4 的冰箱保存或者进行下一步实验。杂拟谷盗、锯谷盗不同虫态的 PCR 反应条件与赤拟谷盗条件基本一致，改良 PCR 反应条件将退火温度分别为改为 48 和 50 。1.2.3简并引物的筛选从培养的杂拟谷盗和锯谷盗试虫中分别挑选数头成虫、
15、幼虫和虫卵放入干净的培养皿内。成虫和幼虫清水洗净放入吸水纸吸干；往放有虫卵的培养皿内加入少量乙醇润湿，再加入适量稀硫酸（1:19= V:V）盖上培养皿，放置于水浴锅上蒸汽浴 8 min，虫卵表面的面粉被去掉，用布氏漏斗低压抽滤，室温晾干。用天平称取 50 mg 小麦粉和占 50 mg 小麦粉总量的 20%、10%、5% 、3%、 2%、1%、0.5% 、0.1%和 0.05%的不同昆虫虫态。称量的昆虫放入 1.5 mL 的无菌离心管中，离心管盖上盖子放入盛有液氮的小容器内，放置 35 min 使之冷却。然后取出离心管并打开盖子使用组织研磨器进行研磨至粉末状，最后往离心管内加入称取的 50 mg
16、 小麦粉混匀，每种处理重复 3 次。表 1 赤拟谷盗延伸因子十对兼并引物的序列反向引物序列（53 ） 正向引物序列（53）EFS319：CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)GEFS409：GAT TTC ATC AAG AAC ATG AT(T/C) ACEFS577：AAC AA(G/A) ATG GAC TC(A/C) ACT GA(A/G) CCEFS622：GA(A/G) GAA AT(T/C) AA(A/G) AAG GAA GT(G/C/A) TCEFA758CCC TTGAAC CA(T/G) GGC AT(T/C) TTGEFS738：AA(A
17、/G0) ATG CC(A/C) TGG TTC AAG GG(A/G) TGGEFS319：CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)GEFS409：GAT TTC ATC AAG AAC ATG AT(T/C) ACEFA1064ACG TTC TT(C/T/G) ACG EFS577：AAC AA(G/A) ATG GAC TC(A/C) ACT GA(A/G) CC5EFS622：GA(A/G) GAA AT(T/C) AA(A/G) AAG GAA GT(G/C/A) TCTTG AA(A/G) CCEFS738：AA(A/G) ATG CC(A/C) T
18、GG TTC AAG GG(A/G) TGG1.2.4不同重量比例的目的基因条带亮度值以 50 mg 小麦粉为准，分别将占 20%、10%、5% 、3%、1%、0.5% 、0.1%和 0.05%等的不同比例且不同虫态的害虫添加入小麦粉中，提取害虫的目的基因并且进行 PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳。利用 Tanon-2500 凝胶成像分析仪和 GIS-1D 图像分析软件计算电泳图中目的基因条带的灰度值作为条带亮度的定量值，计算出害虫含量与条带亮度的关系曲线。1.2.5DNA 指纹检测方法在面粉厂随机抽样检验在郑州金苑面粉有限公司的仓库随机抽取几袋小麦粉，每一袋小麦粉中抽取 500g 的面粉后放在实
19、验室里，共抽取 7 份，每份样品从抽取的面粉放在温度（302），湿度（705）%的培养箱中培养 30 d 后再分成两份，一份进行 DNA 指纹图谱方法面粉虫虫卵的检测，另一份利用筛选法对面粉中的幼虫进行检测得到实际的检测数量。对比 DNA 指纹图谱方法的害虫含量与条带亮度的关系方程计算理论的检测量与时间的检测数量进行比较。2. 结果与分析2.1 三种害虫延长因子基因片段扩增引物的筛选10 对引物相互组合后按照梯度 PCR 的方法优化对三种小麦粉中主要害虫赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗延长因子基因片段进行扩增，结果如图 1 所示：从图 1 可以看出引物 EFS319 和 EFA758 组合的 PCR
20、 产物中，每个退火温度的扩增条带都非常清晰，条带大小符合目的片段且几乎没有引物二聚体和非特异性扩增，说明EFS319 和 EFA758 这对引物可以有效扩增出来特异性条带，可以用于后续试验。因此确定本研究延长因子的正向引物 EFS319：5CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)G3。反向引物 EFA758：5 CCC TTG AAC CA(T/G) GGC AT(T/C) TTG 32.2 DNA 指纹技术检测小麦粉中三种害虫成虫碎片的最低检出限小麦粉中分别加入不同含量的赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗成虫碎片、幼虫和卵。DNA 指纹技术检测后的电泳图如图 2 所示。
21、6由图 2 可知，当成虫碎片含量占 20%时能检测到，直到碎片含量占 2%时仍能检测，但当赤拟谷盗碎片含量为 1%时凝胶成像图中没有条带。对 PCR 条件优化后可以检测杂拟谷盗、锯谷盗碎片含量的最低检测限为 1%。2.3 DNA 指纹技术检测小麦粉中三种害虫幼虫的最低检出限在小麦粉中分别加入不同含量的赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗幼虫。DNA 指纹技术检测后的电泳图如图 3 所示。从图 3 可以看出赤拟谷盗幼虫含量最低检测限是 1%。对PCR 条件优化后可以检测出杂拟谷盗、锯谷盗的幼虫含量最低达到 0.05%。说明了 DNA指纹检测技术可以准确判断小麦粉中幼虫的发生情况。2.4 DNA 指纹技术检
22、测小麦粉中三种害虫虫卵的最低检出限EFS319 和 EFA758 EFS409 和 EFA758 EFS577 和 EFA758EFS622 和 EFA758EFS319 和 EFA1064 EFS409 和 EFA1064 EFS622 和 EFA1064EFS577 和 EFA1064EFS738 和 EFA758 EFS738 和 EFA1064图 1 不同引物组合在不同温度下的 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图M：DNA Marker DL1000 1-12：分别以赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗为模板表示 5060的 3 温度梯度7在小麦粉中分别加入不同含量的赤拟谷盗、杂拟谷盗和锯谷盗虫卵。
23、DNA 指纹技术检测结果如图 4 所示。从图 4 可以看出赤拟谷盗虫卵含量最低检测限是 1% 。对 PCR 条件优化后可以检测出来杂拟谷盗和锯谷盗的卵最低的可以达到 0.05%。说明了 DNA 指纹检测技术可以准确判断小麦粉中虫卵的发生情况。图 3 小麦粉中含赤拟谷盗（A ）、杂拟谷盗（B）、锯谷盗（C）幼虫 DNA 检测结果注：M 为 DL1000 Marker；1 泳道为其目的基因片段；A 中 2-8 依次为赤拟谷盗幼虫含量为20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，9 为小麦粉的目的基因；B 和 C 中 2-10 依次是幼虫含量 20%、10% 、5% 、3%、2%、1%、0.5% 、
24、0.1%和 0.05%， B 和 C 为优化 PCR 反应条件的检测结果；11 为小麦粉的目的基因；CK 为空白对照。M 1 2 3 4 5 6 7 8 CKBM 1 2 3 4 5 6 7 8 CKCM 1 2 3 4 5 6 7 8 CK图 2 小麦粉中含赤拟谷盗（A ）、杂拟谷盗（B ）、锯谷盗（ C）碎片 DNA 检测灵敏度注：M 为 DL1000 Marker，其条带片段长度分别为：1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和 100bp；1 泳道为其目的基因片段；2-7 依次是昆虫碎片含量为 20%、10%、5%、3% 、2%和1%；8 是小麦粉的基因
25、片段；CK 为空白对照，是在 PCR 体系中以无菌水代替目的基因的对照组，主要用作排除底物污染的确定。B 和 C 为优化 PCR 反应条件后杂拟谷盗和锯谷盗的检测结果图A82.5 DNA 指纹图谱亮度与小麦粉中不同害虫碎片含量的相关性将占 50 mg 小麦粉中含有不同含量的害虫碎片进行 DNA 检测，检验后的电泳条带进行亮度分析，得出害虫碎片含量与电泳条带亮度的线性关系如图 5 所示：M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CKCM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CKBM 1 2 3 4 5 6 7 8 CKA图 4 小麦粉中含赤拟谷盗（A ）、杂拟谷盗（B）、锯
26、谷盗（C）卵 DNA 检测灵敏度注：M 为 DL1000 Marker；1 泳道为其目的基因片段；A 中 2-7 依次为赤拟谷盗卵的含量为20%、10%、5% 、3%、1%、0.5%，8 为小麦粉的目的基因；B 和 C 中 2-10 依次为的杂拟谷盗和锯谷盗卵含量 20%、10% 、5% 、3%、2%、1%、0.5% 、0.1%和 0.05%（PCR 优化条件后检测结果）；11 为小麦粉的目的基因；CK 为空白对照图 5 小麦粉害虫碎片含量与 DNA 电泳条带亮度的关系Y=858.36x+74.540r=0.9619亮度值害虫碎片占 50mg 小麦粉的量/mg条带亮度值9由图 5 可知，DNA
27、 电泳条带亮度（Y）与害虫碎片含量（X）呈良好的相关关系。回归方程为：Y=858.36X+74.540（r=0.961 9）。说明可以根据目的基因的琼脂糖凝胶电泳条带亮度预测小麦粉中成虫的数量。2.6 DNA 指纹检测方法在面粉厂成虫检测中应用为了检验 DNA 分子指纹图谱检测害虫的准确性，在面粉厂随机取了 7 份小麦粉，用DNA 指纹技术测定成虫碎片的含量的检测，根据实际害虫发生的情况，利用害虫含量与条带亮度的关系进行了预测，检测值和预测值的结果比较如表 2 所示：从表 2 可以看出：当成虫数量大于 12 以上才能检测出条带亮度。随机取样的小麦粉中害虫的数量多，条带亮度值越高；而且条带亮度值
28、随着实际害虫的数量增加而增加，说明了通过检测目的基因的条带亮度可以初步推测样品中害虫的感染程度。利用 DNA 指纹技术测定 7 份小麦粉样品的害虫含量与实际发生量相比，准确率均在 66.67% 80.56%。结果说明了利用 DNA 指纹技术测定的小麦粉害虫含量可以预测小麦粉中害虫的感染程度，但是检测的准确率有待提高。表 2 随机 7 份小麦粉 30d 后 DNA 指纹技术检测和害虫实际发生情况比较检测结果害虫实际发生情况（头 /kg）样品成虫 幼虫条带亮度 检测成虫的结果（头/kg）准确率/%自制小麦粉 - - - - -样品 1 1 4 - - -样品 2 5 4 - - -样品 3 12
29、17 - - -样品 4 15 14 74.333.38 10 66.67样品 5 15 35 86.552.90 14 77.78样品 6 19 21 90.6710.35 16 76.19样品 7 24 36 114.284.06 29 80.56表中“- ”表示没有检测结果3. 讨论 10Bennett14利用 DNA 指纹技术检测水稻抗病虫害的结果说明 DNA 指纹技术已经提供了关于昆虫和病原菌群体结构独特的信息。因此可以利用储粮昆虫具有基因结构的独特性，采用 DNA 指纹技术进行害虫的检测。Balasubramanian 13等设计了两对不同的兼并引物，用 DNA 指纹技术研究了小麦
30、粉中赤拟谷盗和杂拟谷盗的碎片，其结果为害虫碎片的最低检出限为 1%。本文采用一对通用引物可检测小麦粉中三种不同的害虫，实验操作简单、成本低廉。且幼虫和虫卵的检测灵敏度显著高于成虫碎片的检测。在检测小麦粉中赤拟谷盗成虫、幼虫和卵时应用的 PCR 扩增条件的退火温度是 56 ，在检测小麦粉中的杂拟谷盗和锯谷盗时改良的 PCR 扩增时的退火温度分别为 48 和 50 ，因此检测出赤拟谷盗成虫碎片时的最低检出限为 2%，而对杂拟谷盗和锯谷盗的最低检出限为 1%。而且改良后的 PCR条件可以提高幼虫和卵的检出限。说明了在 DNA 指纹技术检测时 PCR 扩增的条件优化非常关键。本文还发现不同害虫碎片含量
31、与 DNA 片段电泳条带亮度成正相关。对随机取样的面粉检测结果与实际结果准确率最高可达 80.56%。说明 DNA 指纹图谱技术可以预测小麦粉中三种害虫感染程度，但是检测的准确率有待提高。在以后的研究中 DNA 指纹技术不仅可用于定性还可以提高定量的准确性。在应用中可以开发一种快速检测的试剂盒，对于快速检测成品粮中害虫的发生具有重要的指导意义。4. 结论利用 DNA 分子指纹图谱技术检测成虫碎片、幼虫和虫卵检测限分别为 1%、 0.05%和 1%。说明此方法可以检测成虫碎片、幼虫和卵。根据不同害虫碎片含量（X）检测出来DNA 片段电泳条带亮度（Y）之间的关系 Y=858.36X+74.540（r=0.961 9），说明两者存在明显的相关性。利用 DNA 检测技术检测从面粉厂随机抽取的样品，发现实际结果和 DNA检测结果准确率可达 80.56%。说明可以利用 DNA 分子指纹图谱技术预测小麦粉中害虫的感染程度。参考文献1Health Canada, Health Protection Branch Standards and Guidelines for the General Cleanliness of Food - an OverviewJ. Canadian Institute of Food Science & Technology Journal. 1999
