1、 项目名称： 调控内胚层组织器官发育的分子机制研究 首席科学家： 罗凌飞 西南大学 起止年限： 2009.1 至 2013.8 依托部门： 教育部 重庆市科委 一、研究内容 在本项目拟开展的研究工作中，我们将应用斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠等模式动物和胚胎干细胞研究体系，以肝脏和胰腺这两个重要的内胚层器官为主要研究对象，辅以肠道的研究，沿着从内胚层细胞到内胚层器官前体细胞的命运预定、到前体细胞的分化和成熟功能细胞的形成、到器官的形态建成、功能发挥、和受损再生的动态连续过程，全面深入地研究在内胚层组 织器官特别是肝脏和胰腺的发育和再生过程中发挥重要功能的因子、信号途径和表观遗传稳定性的作用机制，并阐明
2、其中可能存在的时间、空间网络关联。按照本项目拟设置的三个课题，具有研究内容如下： 课题一：调控肝脏 和 肠道发育的分子机理研究 1. 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。 1）可 用于 精确 定位和 分选预定的肝脏 、肠道 前体细胞的转基因斑马鱼的建立； 2） 4 6 体节时期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。 2. 在 斑马鱼 预定的肝脏 或肠道 前体细胞中 特异和差 异表达基因 的 筛选及其功能机制研究。 1） 4 6 体节时期 斑马鱼预定的肝脏 、肠道 前体细胞 分选， 两者 之间及其分别与原肠中期内胚层细胞 差异表达基因的芯片筛选 ； 2
3、）差异表达基因发挥功能的分子机理 研究。 3. 肝细胞命运决定后调控 肝脏发育 基因 的 筛选与功能研究。 1）肝脏 发育 不同时期的差异表达基因的芯片筛选； 2） 差异表达基因的功能和作用机理研究。 4. 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。 1）胚胎干细胞向肝脏前体细胞分化过程中命运决定的分子机理； 2）胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的基因表达特性分析，影响其定向分化的关键基因的寻找及作用机理研究； 3）胚胎 干细胞来源的肝脏前体细胞的体外分化能力及分子机理研究。 5. 组蛋白 H3 的 N 端 三甲基化表观遗传调控机制 在由胚胎干细胞到 肝细胞分化过程 中的功能。 1）
4、肝干细胞的形成与分化中组蛋白 H3 N 端 三甲基化与染色质形成的关系； 2）肝细胞 特异的组蛋白 H3 N 端 三甲基化酶的克隆； 3）H3 N 端三甲基化在从胚胎干细胞到肝细胞分化过程中的表观遗传稳定性及功能的系统研究； 4）肝细胞 特异 性 组蛋白 H3 N 端 三甲基化酶在肝细胞形成与分化中的作用与分子机 理。 6. 表观遗传在 斑马鱼 内胚层器官发育的不同阶段的稳定性及其功能的系统研究。 1）在 斑马鱼 内胚层 器官发育的不同阶段 对 H3K4Me3、 H3K27Me3、H3K9/18Ac、 H4K12Ac 的表观遗传稳定性及功能 的系统 化 研究； 2）选取 具有代表性的 表观遗传
5、 位点，研究染色质 上相应位点 附近基因 在调控 内胚层器官 发育 中的 功能 及分子机理 。 7. 具有 肝脏发育 缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制 研究。 1） 具有 肝脏 发育缺陷突变体的表现型 研究； 2） 导致 肝脏 发育缺陷的致变基因 克隆及其调控肝脏发育的分子机理研究 。 8. NEMO/IKK的 K63 多泛素化在调控肝脏发育中的功能与分子机理。 1）NEMO/IKK及其多泛素化在调控斑马鱼肝脏发 育中的功能； 2） NEMO/IKK多泛素化酶的确定及其在肝脏发育中的功能 。 9. Wnt 信号途径及其 上游 调控因子 KLP 在斑马鱼肝脏发育中的功能机制。 1）Wnt
6、信号途径调控 肝脏发育的分子机理； 2） KLP 调控 肝 脏发育 的分子机理 。 课题二：调控胰腺发育的分子机理研究 1. 在 斑马鱼 预定的 胰内外分泌 前体细胞中 差 异表达基因 的 筛选及其功能机制研究。 1）斑马鱼 原肠中后期 内胚层细胞 、 4 6 体节时期 预定的 内、外分泌前体细胞 及 非预定 的胰腺 前体细胞的分选， 四 者差异表达基因的芯片筛选 ；2）差异表达基因的表达模式、功能和作用机制研究。 2. 非洲爪 蟾 预定的胰腺内胚层细胞 特异性调控因子的筛选和功能机制研究。 1）非洲爪蟾囊胚晚期 /原肠早期预定的胰腺内胚层细胞的细胞谱系分析定位；2） 基因芯片比较正常的预定胰
7、腺内胚层细胞与 BMS453 处理过的内胚层细胞、 RA 处理过的内胚层细胞、高表达了 Hex 的内胚层细胞、高表达了 VegT和 -catenin 的爪蟾胚胎多能性前体细胞的基因表达图谱以筛选出决定预定胰腺内胚层细胞的特异性内在调控因子； 3）对筛选所得重要调控因子发挥功能的分子机理研究。 3. 非洲爪蟾胰腺特异性表达的新基因的筛选及功能机制研究。 1）利用大规模整体原位杂交从 非洲爪蟾胚胎及成体的胰腺 cDNA 文库中筛选胰腺特异性表达的新基因； 2）新基因调控胰腺发育的功能及分子机理研究。 4. Hex 特异性地诱导腹侧胰腺前体细胞增多的分子机理研究。 1） Hex 在原肠胚期过量表达诱
8、导巨大腹侧胰腺的细胞机制研究； 2） Hex 的相互作用因子、在染色质上附着位点、下游调控基因的筛选及其调控胰腺发育的分子机理研究。 5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝脏的体外重建。 1）在经过早期紫外线照射形成的爪蟾 belly piece 中选择性地恢复胰腺和肝脏形成的研究。 2）在体外诱导爪蟾胚胎多能性前体细胞形成胰腺及真正成熟的胰岛 细胞的研究。 6. 利用胚胎干细胞体系研究胰腺细胞体外分化的分子机理。 1）分别建立 pdx1和 ngn3 启动子驱动的报告体系； 2）研究 RA, BMP, FGF 等信号途径调控pdx1 表达的分子机理； 3）胰腺前体细胞的基因表达谱分析，胰腺前体细胞向内分泌
9、细胞分化过程中的信号调控机制研究； 4）胰内分泌前体细胞的基因表达谱分析， Ngn3 下游调控基因的表达谱分析 。 7. 具有胰腺 发育 缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制 研究。 1） 具有胰腺发育缺陷突变体的表现型 研究； 2） 导致胰腺发育缺陷的致变基因 克隆及其调控胰腺发育的分子机理研究 。 8. 分离小鼠内胚层组织的成体干细胞，确定干细胞的分化途径以及分化的子代细胞 谱 。 1） 利用三维培养体系，从小鼠胚胎和新生小鼠体内分离和富 集 内胚层组织的干细胞 /前体细胞，确定其表面标记 ； 2） 分析成体小鼠内的干细胞 /前体细胞组分 ； 3） 分析 内胚层组织 干细胞 /前体细胞的
10、 特异 基因表达模式，确定干细胞 /前 体 细胞内特异基因表达 ； 4） 建立体外干细胞 /前体细胞分化体系 ， 确定内胚层 组织的 细胞分化谱 ； 5） 建立体内细胞分化测定体系，确定体内分化 细胞 谱，比较体内外分化谱的异同，明确 内胚层组织的 细胞分化测定手段。 9. 在小鼠胚胎发育过程中，确定 小鼠内胚层组织的干细胞 /祖细胞的形成 、 分化的子代细胞 谱与分化 途径，探索内胚层组织的构筑。 1）标记内胚层特异表达基因，在成体 内胚层组织 内确定基因表达谱的特异性 ； 2） 分离小鼠器官形成期的胚胎，确定特异基因在小鼠胚胎中的组织特异性 ； 3）筛选内胚层分化过程中的 特异表达的基因
11、； 4） 分离 单 细胞到器官形成期的小鼠胚胎，对 胚胎内胚层 细胞进行谱系定位 ，为系统分析小鼠内胚胎发育提供基础 。 10. 建立内胚层组织特异基因条件 敲除 小鼠， 标记内胚层组织起源细胞， 分析内胚层组织的形成与构筑的过程，探讨内胚层组织形成的分子机制。 1）确定内胚层发 育的特异基因 ； 2）构建条件性基因打靶的 ES 细胞 ， 体外分析细胞的分化能力 ； 3）构建条件基因打靶小鼠 ； 4）分析内胚层分化发育的分子基础与分子机制。 课题三： 正向遗传突变筛选具有 内胚层器官发育或再生缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究 1. 斑马鱼肝脏和胰岛 细胞再生模型的建立及 ENU 正向遗传突
12、变筛选研究在肝脏或胰腺发育、肝脏或 细胞再生过程中发挥重要功能的基因及其 作用机制 。 1）斑马鱼肝脏和胰岛 细胞再生模型的建立及再生的细胞过程研究； 2）ENU 化学诱变筛选具有肝脏或胰腺发育缺陷、肝脏或 细胞再生缺陷的突变体及其表现 型研究； 3）致变基因的克隆和功能机制研究。 2. 斑马鱼胰外分泌腺再生模型的建立及 ENU 正向遗传突变筛选研究在胰外分泌腺再生过程中发挥重要功能的基因及其 作用机制 。 1）斑马鱼胰外分泌腺再生模型的建立及再生的细胞过程研究； 2） ENU 化学诱变筛选具有胰外分泌腺再生缺陷的突变体及其表现型研究； 3）致变基因的克隆和功能机制研究。 3. 通过增强子诱捕
13、获得的胰腺 GFP 标记转基因鱼的基因定位、鉴定及功能研究 。 1）对 获得的胰腺 GFP 标记转基因鱼进行基因定位并鉴定候选基因； 2）新 基因 的 功能 及分子机理 研究 。 4. 利用转座子 介导的插入突变 筛选具 有肝脏 、胰腺或肠道 发育缺陷的突变体及致变基因的功能机制研究。 1） 携带转座子的转基因斑马鱼的建立； 2）具有肝脏 、胰腺或肠道 发育缺陷的突变体筛选； 3）致变基因的克隆和功能机制研究。 二、预期目标 （一）总体目标 针对内胚层组织器官的发育与再生领域研究的热点和难点，依托并联合运用本项目申请组已建立的斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠和胚胎干细胞研究平台，揭示调控从内胚层细胞到肝
14、脏和胰腺等主要内胚层器官前体细胞的命运预定和分化、到成熟功能细胞的形成、到器官的形态建成、功能发挥、和受损再生的这一动态连续发育过程中各个阶段的分 子机理。整合各个课题的研究成果，在分子水平上 描绘出调控内胚层 组织 器官发育的整体蓝图 ， 为满足国家对重大疾病防治的迫切需求服务 。 通过本项目的实施，在发现预定的肝脏和胰腺前体细胞的分子标记和重要命运决定因子、揭示内胚层组织器官发育过程中的表观遗传调控机制、阐明调控肝脏和胰腺形态建成及受损再生的分子机理等国际研究前沿领域有所突破，为使我国的内胚层组织器官发育研究进入国际先进行列打下扎实的基础。 （二）五年预期目标 1. 建立并完善我国利用模式
15、动物和 胚胎 干细胞研究 以 肝脏 和 胰腺 为代表的 内胚层 组织 器官发育 和再生 的研究体系。 2. 发现并鉴定预定的肝脏或胰腺前体细胞的分子标记和关键命运决定因子，阐明其发挥功能的分子机理，填补国际上缺乏预定的肝脏和胰腺前体细胞的早期分子标记这一研究空白。 3. 筛选 并 鉴定 5 10 个在内胚层 组织 器官发育过程中及 2 3 个在肝脏或胰腺的再生过程中发挥重要功能的 新 因子， 阐明其发挥功能的分子机理。 4. 构建 2 4 个特异基因 条件 打靶小鼠，初步分析这些基因在内胚层 组织器官发育中的作用。 5. 同时以胚胎干细胞和斑马鱼为研究体系，阐明表观遗传机制特别是组蛋白修饰机制
16、在调控内胚层组织器官发育中的功能及机制。 6. 整合已有的知识及本项目各个课 题的研究成果，深入 揭示多种 因 子 、 信号途径 、表观遗传机制等联合 调控内胚层 组织 器官的前体细胞命运决定、形态建成、功能发挥和受损再生 这一连续 过程 的时空分子调控网络 。 7. 联合我国的斑马鱼研究资源库，本项目实施过程中建立和获得的所有转基因和突变种系都将通过我国的斑马鱼研究资源库成为国内科研工作者的共享资源。 8. 发表 40 50 篇 SCI 学术论文，其中影响因子大于 5 的 15 20 篇， 影响因子大于 10 的 5 10 篇 ；申请专利 4 7 个 。 9. 通过项目培养青年科技骨干人才，
17、 培养高水平博士后 5 10 人、博士研究生50 70 人 ；建立并逐渐壮大 一 支 活跃 在 内胚层 组织 器官发育研究领域的创新团队和中青年学术带头人队伍 ，并至少 有两位青年科学家在项目实施过程中获得国家杰出青年基金资助 。 三、研究方案 （一）技术路线 课题一：调控肝脏 和 肠道发育的分子机理研究 1. 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。 1） 可 用于 精确 定位和 分选预定的肝脏 、肠道 前体细胞的转基因斑马鱼的建立 。建立 sox17:Kaede 和 sox17:Dendra 转基因鱼，这两个转基因系是在斑马鱼中进行内胚层细胞 精确 谱系定位和
18、分选 的重要工具。 2） 4 6 体节时期预定的肝脏和肠道前 体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。利用激光定点激发技术，将 sox17:Kaede 或 sox17:Dendra 转基因鱼中的单个内胚层细胞转变为红色荧光细胞，然后谱系定位红色荧光细胞在内胚层器官中的位置。我们将以单细胞分辨率完成每一个前肠内胚层细胞的谱系定位。 2. 在 斑马鱼 预定的肝脏 或肠道 前体细胞中 特异和 差 异表达基因 的 筛选及其功能机制研 究。 1） 4 6 体节时期 斑马鱼预定的肝脏 、肠道 前体细胞 分选， 两 者 之间及其分别与原肠中期内胚层细胞 差异表达基因的芯片筛选 。 A）根据本课题第 1 部分获得的前
19、肠内胚层细胞谱系定位，在 4 6 体节时期 的 sox17:Kaede 或sox17:Dendra 胚胎中定点激活单一类型的预定前体细胞，然后立即利用FACS 技术分选红色荧光细胞； B）细胞分选后立即提取总 RNA 并制备芯片探针，通过基因芯片分析获得并确证 肝脏 、肠道两种预定的前体细胞之间及其分别与原肠中末期内胚层细胞的差异表达基因。 2） 差异表达基因的功能及作用机理 研究。 A）在差异表达基因克隆并经定量PCR 确证后，首先将研究基因的表达模式，力争获得 10 体节以前预定的肝脏和肠道前体细胞的特异性分子标记； B）研究 mRNA 过表达、 morpholino敲降、内胚层特异性 m
20、orpholino 敲降后的胚胎表现型及其对肝脏和肠道不同发育时期的分子标记表达的影响； C）对于重要功能因子制备特异性抗体，并运用酵母双杂交、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀（对转录因子或结合在染色质上的蛋白复合物成员）筛选其相互作用因子或染色质附着位点，从转录调控、表观遗传调控、蛋白相互作用调控三个方面研究这些因子调控肝脏和肠道早期发育的分子机理。 3. 肝细胞命运决定后调控 肝脏发育基因 的 筛选与功能研究。 1） 肝脏 发育 不同 时期的差异表达基因的芯片筛选 。 机械分离 前肠内胚层区域 组织后， 利用 FACS 技术分离 gutGFP 斑马鱼 的 14hpf、 24 hpf、 48 h
21、pf、 72 hpf和 96 hpf 胚胎中携带 GFP 的细胞，提取总 RNA 后制备探针 进行基因芯片分析，获得并确 证 差异表达基因。 2） 差异表达基因的功能和作用机理研究。 对于 通过基因芯片 获得 的 新基因 ，我们 将 利用基因 过表达 和敲降 、 内胚层特异性敲降、 整体原位杂交、 免疫组化 、酵母双杂交、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等方法 研究 新基因的 功能 及其作用机理 。 4. 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。 1） 胚胎干细胞向肝脏前体细胞分化过程中命运决定的分子机理 。 A） 建立报告体系，标记肝脏前 体细胞 。 Afp 的表达标志着内胚层细
22、胞进一步分化为肝脏前体细胞，因此我们将采用同源重组的方式，建立 afp 启动子驱动报告基因表达的胚胎干细胞系。利用该细胞系，我们可 以定量判断肝脏前体细胞的分化效率，并对肝脏前体细胞进行分离纯化 ； B） 研究关键信号通路 FGF 和BMP 在分化过程中的作用 。 我们已经基本建立了胚胎干细胞向肝脏细胞定向分化的体系，整个分化过程与肝脏体内发育过程相对应，可分为三个阶段：第一、 胚胎干细胞向内胚层细胞分化阶段 ，第二、 内胚层细胞向肝脏前体细胞分化阶段 ，第三、 肝脏前体细胞向成熟肝实质细胞分化阶段。我们 初步研究发现， FGF 和 BMP 信号通路在内胚层细胞向肝脏细胞命运决定过程中可能起到关键的作用。进一步，我们将对 FGF 和 BMP 信号通路及其下游重要
