1、2 个玉米抗矮花叶病分子标记的有效性评价宋茂兴，瞿 会，闫 伟，张旷野，李凤海，朱 敏，钟雪梅，王宏伟，杜万里，吕香玲（沈阳农业大学特种玉米研究所，沈阳 110866）摘要：玉米矮花叶病是玉米重要的病毒病害，培育抗病品种是防治该病最经济有效的方法，常规育种方法与分子育种技术相结合可以大大提高抗病育种的效率。本研究利用前期研究开发的 2 个分子标记 Indel186-9 和 SCAR112，检测 100 份常用玉米自交系的标记基因型，结合 100 份玉米自交系抗性表型鉴定结果进行这 2 个分子标记辅助选择的有效性分析。结果表明，目前种质资源中高抗病材料较少，亟待进行抗病改良。本试验所用的自交系包
2、括不同血缘，抗源主要来源于 PB 和四平头种质。Indel186-9 标记和 SCAR112 标记的选择符合率均达到 80%，同时使用两者选择符合率达到 91.67%，其中抗病选择符合率达到 100%。Indel186-9 和 SCAR112 标记分别可以使抗病级别从平均 7.26 级提高到平均 2.4 级和平均 7.63 级提高到平均 4.27 级。试验证明 2 个标记均可用于对玉米抗矮花叶病材料的选择，正确组合使用可提高对玉米抗矮花叶病材料的选择效率。关键词：玉米；矮花叶病；甘蔗花叶病毒（SCMV） ；分子标记; 选择效率Efficiency Evaluation of Two Molec
3、ular Markers Linked with Resistance to Maize Dwarf Mosaic DiseaseSONG Mao-xing，QU Hui，YAN Wei，ZHANG Kuang-ye，LI Feng-hai，ZHU Min， ZHONG Xue-mei, WANG Hong-wei, DU Wan-li, LV Xiang-ling(Special Maize Institute, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866)Abstract：Maize Dwarf Mosaic Disease is a
4、 main virus disease of maize, and the most effective way of dealing with the disease is the breeding of resistant varieties. The combination of conventional breeding methods and molecular breeding technology can greatly improve the disease-resistant breeding efficiency. In this study, two molecular
5、markers Indel186-9 and SCAR112 developed in previous study were used to identify the genotype of 100 maize inbred lines, and combining phenotype identification, the validity of two molecular markers was investigated for marker-assisted selection (MAS). The results suggest that there were few highly
6、resistant varieties of the germplasm resources and the resistance is pressingly needed to be improved. Inbred lines used in this experiment were made of various blood, and the resistance materials mainly come from PB and sipingtou germplasm. The selection accuracy of both Indel186-9 and SCAR112 were
7、 up to 80%, and the selection accuracy of the two markers used simultaneously for MAS was up to 91.67%，among which the resistant selection accuracy was up to 100%. The two markers improved the average resistant level from 7.26 to 2.4 and 7.63 to 4.27 respectively. It proved that the two markers can
8、be used to select resistant materials of maize dwarf mosaic disease, and the right combination can improve the efficiency of selection.Keywords：maize; maize dwarf mosaic disease; Sugarcane Mosaic Virus（SCMV）; molecular marker；selective efficiency玉米矮花叶病是中国和欧洲玉米产区的主要病毒病害之一，对玉米的品质和产量有很大影响，该病主要由甘蔗花叶病毒（S
9、ugarcane mosaic virus, SCMV，补加英文全称 ）和玉米矮花叶病毒（Maize dwarf mosaic virus, MDMV，补加英文全称）引起 1-3，我国玉米矮花叶病的病原是甘蔗花叶病毒 4。该病害具有爆发性、迁移性和间歇性三大特征，可给生产造成20%80% 的损失 5。从20世纪90年代开始，玉米矮花叶病有逐年加重的趋势，对玉米生产构成了严重威胁，1995年该病大流行，绝收面积超过万亩 6。实践证明，拓宽玉米种质基础，开展抗病遗传育种研究，是防治玉米矮花叶病根本有效的途径。收稿日期：2015-07-10 修回日期：2015-09-28 网络出版日期：基金项目：辽
10、宁省教育厅一般项目( L2012244)；辽宁省自然科学基金( 2013020073)；辽宁省科特派项目（项目编号 2014215031） 第一作者研究方向为作物遗传育种。E-mail：通信作者：吕香玲， 研究方向为玉米分子育种。E-mail：分子标记辅助选择（Molecular marker-assisted selection, MAS，补加英文全称）利用分子标记技术与常规基因鉴定方法相结合，追踪与抗病基因紧密连锁的分子标记快速准确鉴定抗病基因型。常规育种经验与分子育种技术相结合可以大大提高抗病育种的效率。李玉杰等 7利用分子标记辅助选择技术成功改良掖478、昌7-2 、郑58、DH486
11、6 等我国多个玉米骨干自交系的粗缩病抗病性。杨华等 8利用2个与玉米纹枯病抗性基因紧密连锁的2个分子标记对(CML270478)CML270 回交后代选系进行分子标记辅助选择，从中获得一般配合力和特殊配合力都较高的且高抗纹枯病选系478C 4-2-2，所配组合渝单24在2006年已通过重庆市审定。虽然目前在世界范围内都十分重视对玉米矮花叶病抗性机理的研究，也有许多玉米矮花叶病抗性标记的开发，但多用于对抗性基因的定位及基因克隆，鲜见玉米矮花叶病抗病分子标记在实际育种中应用的报道。本试验利用前期研究开发的2个与玉米矮花叶病抗性基因紧密连锁的分子标记Indel186-9 9和SCAR11210对 1
12、00份自交系进行标记基因型分析，结合田间抗性表型鉴定结果，分析2个分子标记辅助选择的有效性，以期获得可用于分子标记辅助育种的高效分子标记。1 材料与方法1.1 试验材料的种植及抗性鉴定100 份玉米自交系为玉米常用骨干自交系，采用人工摩擦接种方法 11进行表型抗病性鉴定。每个自交系种植单行区，2 次重复，行长 4m，16 株/ 行。每个自交系选择行内典型植株 5 株，按发病严重程度确定其抗病级别及抗感表型：采用 1、3、5、7、9 五级分级标准与其相对应划分为高抗、抗病、中抗、感病和高感 5 种表型。1 级：植株叶片无症状为高抗（HR），3 级：植株叶片有少量花叶（褪绿）为抗病（R），5 级：
13、植株少量叶片表现花叶为中抗（MR），7 级：植株半数叶片花叶枯黄、植株略矮为感病（S），9 级：植株叶片严重花叶枯黄、植株变矮、果穗小甚至不结实为高感（HS）。1.2 材料取样及 DNA 提取在 34 叶期每个自交系选取 5 株，每株取等量叶片混合，采用 CTAB 法提取基因组 DNA12。1.3 标记的 PCR 扩增与检测2 个要评价甘蔗花叶病毒抗病基因连锁分子标记分别为 Indel186-9 和 SCAR112。Indel186-9 标记引物序列:Indel186-9 F 5- TTCCCAGCAGGTGAAGTAGAA -3，Indel186-9 R 5- GGAGTACCTCAGCTA
14、CCTGGA -3；SCAR112 标记引物序列：SCAR112 F 5- GCCATTGACGCTCTGTATC-3，SCAR112 R 5- TTAAACTACGAACCGAAAGG-3。PCR 扩增采用反应总体积为 10L 的反应体系。其中模板 DNA 终含量 25ng，Taq 酶 0.5 U，引物单链浓度 0.26mol/L，dNTP 终浓度 250mol/L。反应液上加盖 15L 矿物油（Sigma） ，以防止反应过程中水分蒸发。PCR 扩增反应在 PTC-200 PCR 仪（MJ Research , Waterson, MA）上进行。Indel186-9 标记引物热循环反应程序：
15、Step1：94，5min ；Step2 ：94，45s；Step3：60，45s；Step4 ：72 ，1 min；Step5 ：34 cycles from Step2；Step6 ：72，10min ；Step7：4 ，12h；Step8：End。SCAR112 标记引物热循环反应程序： Step1：94，5min ；Step2：94，45s；Step3 ：55 ，45s；Step4 ：72，1 min；Step5：34 cycles from Step2；Step6：72，10min；Step7：4，12h；Step8 ：End。PCR 扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色、
16、白炽灯下读取电泳胶板上的扩增片段的方法进行检测。1.4 扩增带型读取及统计白炽灯下读取扩增片段。对于自交系扩增片段，在相同迁移率位置上，Indel186-9 标记有 3 种带型，分为大、中、小，其中抗病带型片段最大，感病带型有 2 种，一种扩增片段小、一种居中。SCAR112 标记的带型表现为有无 2 种带型，其中抗病带型为有清晰扩增带，感病带型为无清晰扩增带。1.5 分子标记检测结果的统计分析1.5.1 标记检测结果与表型关系分析 根据标记带型进行分组，利用 Excel 2010 分析软件 T 测验对含有抗性标记带型的自交系与不含有抗性标记带型的自交系的抗病性进行差异比较。1.5.2 单一分
17、子标记在自然群体中的选择符合率 单一分子标记选择抗病符合率=标记检测为抗病带型的样品中表型为高抗、抗病及中抗的自交系总数/标记检测为抗病带型的自交系个数100；单一分子标记选择感病符合率=标记检测为感病带型的样品中表型为高感及感病的自交系总数/标记检测为感病带型的自交系个数100。1.5.3 2 个标记组合在自然群体中的选择符合率 标记组合选择的抗病符合率=2 个标记共同检测为抗病带型的样品中表型为高抗、抗病及中抗的自交系总数/2 个标记共同检测为抗病带型的自交系个数100；标记组合选择的感病符合率=2 个标记共同检测为感病带型的样品中表型为高感及感病的自交系总数/2 个标记共同检测为感病带型
18、的自交系个数100。2 结果与分析2.1 玉米自交系抗感表现及在各种质类群中的分布特点借助中国农业科学院作物科学研究所玉米室对种质类群分类的结果 13，本研究对 100 份自交系的抗病性与种质类群的关系进行总结和分析（表 1） 。由表 1 可见，所鉴定的材料中，高感材料最多占 43%，其次是感病材料占 24%和抗病材料占 17%，中抗材料占 9%，高抗材料最少占 7%。根据种质类群的划分，对 100 份自交系的抗感分布情况进行整理（表 2）和比较（图 1） ，PB 种质多表现为高抗和抗病；Lancster 种质的抗病性均在中抗以下水平，且高感和感病材料较多；四平头种质中没有高抗材料，抗病、中抗
19、、感病和高感材料均有，其抗病材料偏多；PA、BSSS 和旅大红骨种质抗感表现较相似，种质中高感材料较多；血缘混杂的材料也多表现感病。表 1 100 份玉米自交系抗病性及种质类群Table 1 The disease resistance and germplasm group of 100 maize inbred lines自交系 抗病性鉴定 种质类群 自交系 抗病性鉴定 种质类群Inbred line Resistant performance Germplasm cluster Inbred line Resistant performance Germplasm cluster多黄 2
20、9 HR PB H21 MR 四平头丹 3130 HR PB 黄早四 MR 四平头丹 599 HR PB R2040 MR 血缘混杂齐 319 HR PB 501 MR PA沈 137 HR PB CA339 MR 血缘混杂P138 HR PB 吉 465 MR Lancster金黄 96B HR PB 铁 9010 MR 旅大红骨黄 C HS PA CN4379 MR PAK14 HS PA 中黄 68 MR BSSSK12 HS 四平头 中自 01 R PB掖 478 HS Lancster 鲁原 133 R 四平头吉 853 HS 四平头 CN962 R 四平头豫 12 HS Lancs
21、ter 32 R 不确定B73 HS BSSS 川 321 R 血缘混杂U8112 HS BSSS 昌 7-2 R 四平头杂 C546 HS 血缘混杂 黄野四 R 四平头丹 340 HS 旅大红骨 141 R PBC8605-2 HS PA M14 R BSSS沈 5003 HS PA R18(18599) R PB沈 118 HS PB 唐四平头 R 四平头77 HS Lancster X178 R PB吉 63 HS 血缘混杂 81565（1） R 旅大红骨8415 HS 旅大红骨 齐 318 R PB辽 2345 HS PA 沈 136 R PB辽 3053 HS PA 鲁原 92 R
22、旅大红骨辽 5114 HS PA SH15 R PB合 344 HS 血缘混杂 吉 412 S Lancster东 156 HS 旅大红骨 吉 419 S Lancster3189 HS PA 吉 477 S BSSS吉 846 HS Lancster 辽白 371 S 血缘混杂吉 495 HS Lancster 81565（2） S 旅大红骨长 3 HS 旅大红骨 5213 S Lancster甸 11 HS 旅大红骨 获唐黄 S 血缘混杂WF9 HS 旅大红骨 CA112 S 旅大红骨W24 HS BSSS 旅九宽 S 旅大红骨7922 HS BSSS 龙抗 11 S 血缘混杂掖 5210
23、6 HS BSSS 1029 S BSSS武 314 HS 四平头 65232 宽 S PACA091 HS Lancster 旱 21 S 四平头Mo17 HS Lancster 吉 1037 S Lancster红玉米 HS 旅大红骨 K22 S PACA156 HS PA 8902 S BSSSCA335 HS 旅大红骨 川 273 S 血缘混杂丹 9046 HS BSSS 莫群 17 S 血缘混杂CN165 HS 血缘混杂 自 330 S 血缘混杂掖 107 HS BSSS D 黄 212 S 四平头郑 58 HS PA 102 S PBCML51 HS 血缘混杂 515 S 四平头E
24、28 HS 旅大红骨 803 S PA东 91 HS 血缘混杂 综 31 S 血缘混杂血缘混杂是指材料含有 2 个以上类群的血缘成分；血缘不确定是缺少该种质的分类结果Blood mixture refers to contain two or more components of blood groups. Blood uncertain refers to lack the classification results. HR: highly resistant, R: resistant, MR: medially resistant, S: susceptible, HS: highly
25、 susceptible. 表 2 不同种质类群中抗感材料的分布Table 2 The distribution of resistant and susceptible inbred lines in different germplasm抗病等级Resistance levelPB PA 四平头SPTLancster BSSS 旅大红骨Red axis血缘混杂Blood blend不确定Uncertain合计Total高抗 HRHighly resistant7 0 0 0 0 0 0 0 7抗病 RResistant7 0 5 0 1 1 1 1 16中抗 MRMedially resi
26、stant0 2 2 1 1 1 2 0 9感病 SSusceptible1 3 3 4 3 4 7 0 25高感 HSHighly susceptible1 10 3 7 7 9 6 0 430510自交系个数numberofInbred lines 种 质 germplasm高 抗 HR 抗 病 R 中 抗 MR 感 病 S 高 感 HS图 1 不同种质类群中抗感自交系分布比较Fig.1 The comparison of resistant and susceptible inbred lines from different germplasm2.2 玉米自交系标记基因型分析利用 In
27、del186-9 和 SCAR112 引物分别检测了 100 份玉米自交系的基因型，结果见图 2 和图3。Indel186-9 是共显性标记，对自交系检测的带型分为 5 种情况，其中 10 份材料扩增出大片段，21 份材料扩增出中片段，61 份材料扩增出小片段，4 份材料扩增出大小杂合带型，4 份材料扩增出中小杂合带型。SCAR112 为显性标记，对自交系检测的带型分为 2 种情况，其中 30 个自交系有扩增带，70 个自交系没有扩增带。120 分别代表 20 个电泳泳道。如第 3 泳道具有 3 条电泳片段，最上面的定义为大片段、最下面的定义为小片段，中间的定义为中片段。1、2、4、5、6、8
28、、10、12、13、14 泳道属小片段基因型， 9、16、18、20 泳道属中片段基因型，15、17 泳道属大片段基因型， 3、7、11、19 泳道属大小杂合基因型1-20 respectively represent 20 electrophoretic lanes. Such as lane 3 has three segments of electrophoresis, defined as a large fragment on the top and the bottom is defined as a small fragment, the fragment in the midd
29、le is defined as mid-fragment. 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 14 lanes are small fragments genotype, 9, 16, 18, 20 lanes are mid-fragments genotype, 15, 17 lanes belong to larger fragments genotype, 3, 7, 11, 19 lanes size heterozygous genotype.图 2 标记 Indel186-9 在玉米自交系中扩增后的部分电泳结果Fig. 2 The sectional
30、electrophoresis results of marker Indel186-9 in 100 maize inbred linesComment c1: 改为差异显著或极显著，修改下文Comment c2: 补加英文翻译1-19分别代表 19个电泳泳道。有目标扩增带：1、2、3、4、6、7、9、10、11、13 泳道，无目标扩增带：5、8、12、14、15、16、17、18、19 泳道1-19 respectively represent 19 electrophoretic lanes. Target fragment electrophoretic bands:1,2,3,4,6
31、,7,9,10,11,13;No target fragment electrophoretic bands:5,8,12,14,15,16,17,18,19图 3 标记 SCAR112在玉米自交系中扩增后的部分电泳结果Fig.3 The sectional electrophoresis results of marker SCAR112 in 100 maize inbred lines2.3 2个分子标记对玉米抗病性提高的效果分析2.3.1 Indel186-9标记产生的抗病性效果 基于 Indel186-9标记的电泳检测结果，将自交系分为 3组（纯合大片段组，含有大片段的杂合带组，中、
32、小片段组） ，分别计算 3组自交系的平均抗病等级，并对其两两进行 T测验以检验其差异是否显著。如表 3 所示，含有纯合大片段的自交系共有 10个，其表型等级平均值 2.4级；含有大片段杂合带型的自交系 4个，其表型等级平均值 3.5级；不含有大片段的自交系 86个，其表型等级平均值 7.26级。T 测验结果表明纯合大片段组和含有大片段的杂合带组，表型等级平均值差异不显著，此两组表型等级平均值与含有中、小片段组表型等级平均值差异极显著均具有统计学意义。该结果说明含有大片段的杂合带型自交系表型偏向含纯合大片段自交系，利用该标记对遗传材料进行选择可以提高材料对玉米矮花叶病的抗病性。表 3 标记 In
33、del186-9对自交系检测表型差异的比较Table 3 The significant difference testing of marker Indel186-9 on the maize inbred lines自交系数目Number of inbred line抗病等级平均值The average of resistance level显著性Sig.(2-tailed)电泳带型Electrophoretic bands1级 HR 3级 R 5级 MR 7级 S 9级 HS纯合大片段 Single larger fragment 6 2 1 1 0 2.40 a含有大片段的杂合带型He
34、terozygous genotype containing larger fragment0 3 1 0 0 3.50 a中、小片段Small or mid-fragment1 11 7 24 43 7.26 b2.3.2 SCAR112 标记产生的抗病性效果 基于 SCAR112 标记的检测结果，将自交系分为 2 组（有带组、无带组） ，分别计算 2 组自交系的平均抗病等级，并对其进行 T 测验以检验其差异是否具有统计学意义。如表 4 所示，有带组的自交系共有 30 个，其表型等级平均值达到 4.27 级，无带组的自交系 70 个，其表型等级平均达到 7.63 级，二者差异极显著。该结果说
35、明利用该标记对遗传材料进行选择可以提高材料对玉米矮花叶病的抗病性。表 4 标记 SCAR112 对自交系检测表型差异的比较Table 4 The significant difference testing of marker SCAR112 on the maize inbred lines自交系数目Number of inbred line电泳带型Electrophoretic bands1 级 HR 3 级 R 5 级 MR 7 级 S 9 级 HS抗病等级平均值The average of resistance levelT 值T显著性Sig.(2-tailed)有带Target fr
36、agment7 10 4 5 4 4.27无带No target fragment0 6 5 20 39 7.63-7.08 0.00*2.4 2 个分子标记的选择效率分析评价 2 个标记的选择效率。Indel186-9 标记的大片段组和含有大片段的杂合带组对自交系表型选择的差异不显著，故将其共同作为抗病带型。从表 5 可看出，具有 Indel186-9 标记抗病带型的自交系有 14 个，其中表型鉴定为抗病的有 13 个，抗病选择符合率为 92.86%；具有 Indel186-9 标记感病带型的自交系有 86个，其中表型鉴定为感病的有 67 个，感病选择符合率为 77.91%，总符合率达到 8
37、0.00%。具有 SCAR112标记抗病带型的自交系有 30 个，其中表型鉴定为抗病的有 21 个，抗病选择符合率为 70.00%；具有SCAR112 标记感病带型的自交系有 70 个，其中表型鉴定为感病的有 59 个，感病选择符合率为 84.29%，总符合率也达到 80.00%。同时利用 2 个标记进行分析，具有抗病带型的自交系有 8 个，其表型鉴定均表现高抗或抗病，2 个标记组合对自交系的抗病选择符合率达到 100%。2 个标记检测均不含任何抗病带型的自交系有 64 个，其表型鉴定表现感病及高感表型的自交系有 58 个，标记组合的感病选择符合率为 90.63%。总符合率达到 91.67%。
38、表 5 分子标记检测与田间抗感表型的符合率Table5 Marker-assisted selection efficiency 抗病性表现 Phenotype 符合率( %) MAS efficiency抗病 感病 各自 总计标记Marker标记带型Genotype自交系个数Inbred linenumber Resistant Susceptible Seperatly Total抗 14 13 1 92.86Indel186-9感 86 19 67 77.9180.00抗 30 21 9 70.00SCAR112感 70 11 59 84.2980.00抗 8 8 0 100两标记联合C
39、ombination 感 64 6 58 90.6391.673 结论与讨论利用与抗病基因紧密连锁的分子标记跟踪目标基因是抗性基因转育和聚合育种的重要手段。但分子标记辅助选择的效率很大程度上依赖标记与目标基因的连锁程度。目前在矮花叶病抗性育种中未见有高效的分子标记使用的报道。本研究对前期研究开发的 2 个分子标记 Indel186-9 和 SCAR112 进行了有效性评价。2 个标记的选择符合率均在 80%以上，同时使用两者选择符合率达到 91.67%，其中 Indel186-9 标记的抗病选择符合率达到92.86%，同时使用两者抗病选择符合率达到 100%。而且利用该标记对遗传材料进行选择可
40、以明显提高材料对玉米矮花叶病的抗病性，Indel186-9 和 SCAR112 标记分别可以使抗病级别从平均病级 7.26 级提高到平均 2.4 级和 7.63 级提高到平均 4.27 级。这说明 2 个分子标记均与玉米抗矮花叶病基因紧密连锁。目前种质资源中高抗病材料较少，亟待进行抗病改良。本试验所用的自交系群体来自不同血缘，遗传背景不同，2 个分子标记对于抗感材料差异的选择仍达到极显著水平，证明其对于不同遗传背景的自交系抗病材料有很好的选择效果，可以直接应用到玉米抗矮花叶病育种实践中，与常规育种相结合可大大提高玉米抗矮花叶病育种的效率与进程。国内外利用分子标记进行玉米抗矮花叶病基因定位，研究
41、结果表明，有 2 个主效抗病基因分别位于第 3 和第 6 染色体上 14-21。本研究使用的 Indel186-9 标记位于第 3 染色体主效基因附近，SCAR112 标记位于第 9 染色体上。Indel186-9 标记是通过基因精细定位后发掘候选基因得到的候选基因标记， SCAR112 标记是通过 BSA 法和 AFLP 标记技术结合开发出来。从二者检测效率来看 Indel186-9 标记检测符合率高于SCAR112 标记，但二者结合检测符合率更高。推测 SCAR112 标记附近存在有玉米抗矮花叶病基因。本研究未能在第 6 染色体的主效基因处找到适合用于标记辅助选择的标记，如果能够在第 6
42、染色体上开发出连Comment c3: 补加卷号，即：年份，卷号（期号）：页码Comment c4: 修改同上Comment c5: 英文发表的请替换为英文锁标记，将能更大的提高标记辅助选择效率。参考文献1 Louie R, Findley W R, Knoke J K, et al. Genetic basis of resistance in maize to five maize dwarf mosaic virus strains J. Crop Sci,1991,31:14-182 Shukla D D, Tosic M, Jilka J. Taxonomy of potyvirus
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