1、重庆地区羊传染性脓疱与病原菌混合感染的检测与分析许国洋 1，付利芝 1，徐登峰 1，龙小飞 2，陈朝洪 2，李 龙 2，张素辉 1*（1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460，2.重庆市武隆区畜牧兽医局，重庆 武隆 408500）摘 要：采集山羊口唇部痂皮，通过PCR检测、 MDBK细胞培养、电镜观察、间接免疫荧光（ IFA）检测对羊传染性脓疱病毒进行系统鉴定，同时，分离培养病灶部位主要病原菌，进行分子鉴定、致病性和药敏试验检测，初步分析病原特性。结果表明，共分离到1 株羊传染性脓疱病毒，3 种病原菌，通过对病原菌16S rDNA基因序列比对分析，发现其分别与多动物链球菌、金黄色葡萄球菌
2、和溶血性曼氏杆菌同源性较高，在系统进化发育树中分别与其聚为一簇。致病性分析，发现多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌对小鼠的致死率高达100%。3种病原菌主要侵染部位为小鼠心脏、肝脏和肺脏，能够引起肺脏和肝脏明显病变。药敏试验表明，3种菌均对舒巴坦、阿米卡星和培氟沙星等6种药物高度敏感。本研究首次从羊传染性脓疱病变部位分离到多动物链球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性曼氏杆菌，为该病在重庆地区的流行特点和防治技术研究提供了理论依据。关键词：羊传染性脓疱；病原菌；混合感染；多动物链球菌；金黄色葡萄球菌；溶血性曼氏杆菌中图分类号：S827； S855 文献标识码:A Detection and analysis
3、of mixed infection of contagious ecthyma and pathogenic bacteria in goats of ChongqingXU Guo-yang1, FU Li-zhi1, XU Deng-feng1, LONG Xiao-fei2, CHEN Chao-hong2, LI Long2 , ZHANG Su-hui1*（1.Chongqing academic of science and techenology, Chongqing 402460, China; 2. Wulong District Bureau of Animal Husb
4、andry, Chongqing 408500, China）Abstract: PCR detection, MDBK cell culture, electron microscopy and indirect immunofluorescence (IFA) were carried out for the systematic identification of contagious ecthyma in goats. The pathogens were isolated and cultured, identified by molecular identification , p
5、athogenic analysis and drug sensitivity test at the same time.The result showed that one virus strain and three kinds of pathogenic bacteria were successfully isolated. The pathogenic bacteria respectively were Streptococcus pluranimalium, Staphylococcus aureus, Mannheimia haemolytica according to t
6、he 16S rDNA identification. And each pathogenic bacteria formed a separate with the corresponding strains according to the system development of the evolutionary tree, respectively. The result of pathogenic analysis showed that the fatality rate in mice of Streptococcus pluranimalium and Mannheimia
7、haemolytica were as high as 100%.The main infection sites of the three pathogens were mouse heart, liver and lung, which could cause obvious lesions in the lungs and liver.The drug sensitivity test showed that all three strains were highly sensitive to six drugs, such as sulbactam, amikacin and pefl
8、oxacin , et al. Streptococcus pluranimalium, Staphylococcus aureus and Mannheimia haemolytica were successfully isolated for the first time from the diseased region of contagious ecthyma in this study, it laid a foundation for the research of epidemic characteristics and control technique of contagi
9、ous ecthyma in goat.Keywords:contagious ecthymain in goats; pathogenic bacteria; mixed infection; Streptococcus pluranimalium; Staphylococcus aureus; Mannheimia haemolytica收稿日期：2017-04-12基金项目：重庆市基本科研业务费专项资助项目（16433）；武隆区科技计划资助项目（17321）作者简介：许国洋（1987-），男，助理研究员，硕士。通讯作者：张素辉， E-mail：羊传染性脓疱（ goat contagiou
10、s pustular dermatitis ）又称羊口疮，是由羊传染性脓疱病毒引起的一种病毒性人畜共患病。羊传染性脓疱病毒为双链 DNA 病毒，属于脊索动物痘病毒科副痘病毒属，该病毒易感动物为山羊和绵羊，主要引起羊只口唇、舌、乳房等部位出现脓疱和丘疹，后期形成痂皮，其被认为是 20 个感染山羊和绵羊最重要病毒性疾病之一，可对农业生产造成严重危害 1-2。重庆地区因其独特的地形地貌和湿热气候，导致羊只疫病种类日趋复杂，给疫病防控工作带来巨大困扰，严重影响养羊业发展。研究表明，羊传染性脓疱可与病毒、支原体、衣原体等混合感染，因此，明确该病的病原，研究其混合感染情况对该病的致病机理研究和疫病防控十分
11、关键 3-4。通过对重庆地区羊传染性脓疱长期临床诊断，我们发现该病发展与创口部位细菌的混合感染相关联，关于该方面的报道相对较少，本研究针对羊传染性脓疱混合感染的主要病原菌进行分离鉴定和致病性分析，为该病致病机理的进一步探索奠定基础，也为该病的防控技术研发提供了理论依据。1 材料与方法1.1 主要试剂 细菌及病毒基因组提取试剂盒、2Taq PCR Master Mix 和 DL-2000 Marker 均由天根生化科技(北京)有限公司提供；参照张素辉 5的方法设计细菌 16S rDNA 基因序列通用引物 F/R，依据 NCBI 中公布的羊传染性脓疱病毒 F1L 基因序列，设计特异性引物 F1/R
12、1，引物由上海生物工程有限公司合成，引物信息见表 1。表 1 引物序列信息名称 序列信息(5-3) 产物大小/bp细菌通用引物 F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAGR: ACGGCTACCTTGTTACGACTT1 500F1L 基因序列引物 F1： ATGG ATCCACCCGAAATR1：TCACACGATGGCCGTGAC 7081.2 试验动物 SPF 级健康昆明种小鼠，体质量为 1825 g，雌雄各半，购自西南大学荣昌校区；患病羊只为重庆某区县养殖场羊传染性脓疱疑似病例。1.3 病毒的 PCR 鉴定 利用病毒基因组提取试剂盒提取疑似病例口唇部痂皮组织基因组，进行羊传染性脓疱
13、病毒特异性序列 PCR 扩增，将 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送往生工生物工程有限公司进行测序分析。1.4 电镜观察及间接免疫荧光 病毒接种单层 MDBK 细胞培养 48 h 后，倾去细胞培养瓶中的维持液，加入 2.5%戊二醛( 用 pH 7.4 PBS 制备 )在 4固定后，送往重庆医科大学进行扫描电镜观察。将 MDBK 细胞接种至 96 孔板，待长成单层后，接种病毒液，37培养 48 h；小心吸去维持液，参照刘嫒 6的方法进行间接免疫荧光检测，荧光显微镜下观察结果，亮绿色荧光者判定为阳性。1.5 主要病原菌的分离鉴定 将患病羊固定，采样前用浓度 75%的酒精棉球擦拭病灶表面，
14、采集羊只口唇部痂皮后，从创口部位无菌取样接种小牛血清平板，进行病原菌分离纯化和革兰染色鉴定。1.6 进化树的构建 对各分离菌株基因组进行 16S rDNA 基因序列进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送往生工生物工程技术有限公司测序，在 NCBI 中进行 Blast 比对，并借助 MEGA5.0 软件，利用 N-J 法构建系统进化发育树。1.7 致死率 挑取各病原菌单菌落进行扩大培养，用 PBS 稀释成 108 CFU/mL，将不同菌株菌液通过腹腔注射接种小鼠 0.2 mL/只，各菌株分别接种 10 只，并设对照组，腹腔注射 PBS 0.2 mL/只，正常饲喂 72 h，每 12 h 观察记
15、录 1 次小鼠累计发病死亡情况。1.8 病变观察 对死亡小鼠进行剖检，观察各组织器官病变情况。1.9 组织分布 从死亡小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行病原菌的再分离，分析病原菌在组织器官中的分布情况。2.0 药敏试验 采用常规纸片琼脂扩散（K-B）法，检测各菌株对 28 种常用抗菌药物的药物敏感性，依据抑菌圈直径大小判定各菌株对药物的敏感性，抑菌圈直径15 mm 的为高度敏感。2 结 果2.1 PCR 鉴定 通过对部分样本羊传染性脓疱病毒 F1L 基因序列进行扩增，发现在700 bp 位置出现单一条带，测序发现产物大小为 708 bp，与预期结果一致（图 1）。2.2 扫描电镜观察及间接免
16、疫荧光 感染病毒 48 h 的细胞培养物进行电镜观察发现，MDBK 细胞浆中出现大量呈椭圆形或卵圆形的病毒粒子（图 2A）。间接免疫荧光试验发现，接种了病毒的 MDBK 细胞胞浆内呈现出大量特异性亮绿色荧光信号（图 2B），空白对照细胞未能激发出荧光信号。图 1 部分样本 PCR 鉴定结果 M.DL2000 DNA Marker；110.F1L 基因 PCR 产物2.4 病原菌的分离鉴定 利用细菌分离培养技术对病原菌进行分离纯化，共分离到 3种不同形态的病原菌，其中 2 种为革兰阳性菌（图 3A，C），1 种为阴性（图 3B）。 2.5 进化树的构建 通过对 16S rDNA 基因序列在 NC
17、BI 中 Blast 比对，发现其分别与金黄色葡萄球菌、多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌同源性最高，且在系统进化发育树中也分别与其聚为一簇（图 4）。2.6 致死率 通过小鼠攻毒试验，发现金黄色葡萄球菌、多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌对小鼠有致病性，试验组小鼠均攻毒 4 h 后出现精神萎靡，反应迟钝等症状，12 h 后图 2 扫描电镜观察及间接免疫荧光结果 A.胞浆中病毒粒子（Bar=1m）；B.间接免疫荧光；C.空白对照图 4 系统进化发育树图 3 革兰染色结果 A.细菌分离株 1（1 000）；B.细菌分离株 2（1 000）；C.细菌分离株 3（1 000）革兰氏染色结果相继出现死亡，溶血性曼
18、氏杆菌和多动物链球菌组 10 只小鼠均在攻毒 48 h 内全部死亡，致死率为 100%。金黄色葡萄球菌组有 6 只小鼠在攻毒 48 h 时死亡，致死率为 60%。对照组无死亡病例（图 5）。2.7 组织病变 对死亡小鼠进行剖检发现，葡萄球菌、多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌均可引起小鼠心脏、肝脏和肺脏不同程度病变，其中，代表性症状为肺脏大面积出血和肝脏点状出血，结果见图 6。2.8 组织分布 通过对死亡小鼠进行剖检和病原菌的再分离，发现各病原菌均可从心脏、肝脏和肺脏中检测到，在脾脏中的检出率均较低，结果见图 7。图 5 小鼠累计死亡情况 图 6 组织病变 A.肺脏； B.肝脏图 7 各菌株在组织中
19、的检出率2.9 药敏试验 通过对各病原菌敏感药物的筛选，发现 3 株病原菌对舒巴坦、阿米卡星、培氟沙星、复方新诺明、甲氧苄啶和氟苯尼考均高度敏感，对强力霉素均中度敏感，而对头孢克洛、壮观霉素、多黏菌素和克拉霉素均不敏感，对其他药物敏感性各不相同，结果见表 2。表 2 药敏试验结果 药物名称金黄色葡萄球菌溶血性曼氏杆菌多动物链球菌药物名称金黄色葡萄球菌溶血性曼氏杆菌多动物链球菌氨苄西林 R M R 强力霉素 M M M青霉素 R S R 诺氟沙星 S R R阿莫西林 R S S 氧氟沙星 M S R头孢噻亏 M M S 培氟沙星 S S S头孢曲松 S S R 复方新诺明S S S先锋必素 S
20、S R 甲氧苄啶 S S S先锋霉素 5 M S R 多黏菌素 R R R舒巴坦 S S S 克林霉素 R R M阿米卡星 S S S 阿奇霉素 R R S头孢克洛 R R R 红霉素 R S S庆大霉素 R M M 氟苯尼考 S S S卡那霉素 S M S 洁霉素 R R S链霉素 R R R 克拉霉素 R R R新霉素 S S R 乙酰螺旋霉素R S S壮观霉素 R R R 利福平 R S S四环霉素 S M MS. 高度敏感；M.中度敏感；R.不敏感3 结 论羊传染性脓疱具有传播快、发病率高、致死率低的特点，主要感染羊只口唇部、尾根部、乳房等部位，具有典型的临床症状，病毒主要侵染宿主动物
21、的上皮组织，损害皮肤黏膜，破坏机体天然保护屏障，导致侵染部位形成脓疱、丘疹，破溃后形成痂皮，伤口处理不及时，给其他病原微生物的侵袭创造了有利条件，常导致该病与其他疫病混合感染，严重危害动物机体健康 7-10。颜新敏等 11发现羊传染性脓疱可与山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎混合感染，并对其进行了流行病学分析，肯定了对羊传染性脓疱混合感染研究的必要性。黄东宣等 12经临床观察、病理解剖和实验室诊断发现羊传染性脓疱可与山羊痘混合感染，并对其防控技术进行了探讨。李才勇等 13研究发现，羊传染性脓疱可与传染性角膜炎混合感染，发病率为 84.70%，致死率为 14.46%。陈德双等 14发现山羊传染性脓疱病毒
22、和坏死杆菌存在混合感染现象，并在山羊脐部和舌根发现坏死杆菌的存在，而在唇部和耳廓部位的丘疹中未发现致病菌。通过长期的临床诊断和实验室检测，我们发现羊传染性脓疱混合感染病例中，与病原菌的混合感染现象最为严重，这可能与病毒感染后引起羊只皮肤黏膜破溃，导致创口暴露有关。通过对羊传染性脓疱和病原菌的分离鉴定，我们发现其与葡萄球菌、多动物链球菌和溶血性曼氏杆菌存在混合感染现象，其中多动物链球菌和溶血性曼氏杆的致死率最高，主要引起小鼠的肝脏和肺脏的出血，3 种病原菌主要侵染的部位是心脏、肝脏和肺脏等组织。通过药物敏感性试验，发现，各菌株均对舒巴坦、阿米卡星和培氟沙星等 6 种药物高度敏感，对头孢克洛、壮观
23、霉素、多黏菌素和克拉霉素具有药物抗性。本研究首次针对羊传染性脓疱混合感染的病原菌进行分离鉴定，并成功分离到多动物链球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性曼氏杆菌，弥补了重庆地区羊传染性脓疱与病原菌混合感染研究的空白，为混合感染检测方法的建立奠定了基础，也为该病的致病机理和防控技术研究提供了理论依据。参考文献1 DAVARI S A, SAYYARI M, MOHAMMADI A. Histopathological study and F1L gene sequence analysis of contagious ecthyma in small ruminants of Shiraz suburb,
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