1、江汉鸡蛋壳颜色色素分析及相关基因表达研究摘要：试验以白色、粉色、褐色 3 种蛋壳颜色的鸡蛋为研究材料，分析色素在血液和蛋壳上的表现规律，检测了相关候选基因在鸡器官中的表达情况。结果表明，原卟啉含量的不同是造成褐色鸡蛋蛋壳颜色深浅不一的主要因素，脾脏可能是蛋壳色素原卟啉形成的重要器官，CPOX和 FCEH 基因可能是原卟啉形成的关键基因，胆绿素沉积的相关有机阴离子转运家族成员在原卟啉沉积过程中无显著作用。 关键词：蛋壳颜色；原卟啉；候选基因；江汉鸡 中图分类号：S831 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0508-03 DOI：10.14088/ki.issn0439
2、-8114.2017.03.029 Study on Pigments of Eggshell Color and Candidate Genes Analysis of Jianghan Chicken SHEN Jie，ZHENG Chuan-wei，PAN Ai-luan，LIANG Zhen-hua，WU Yan，DU Jin-ping ， ZHANG Hao， PU Yue-jin，PI Jin-song （Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Hubei Academy of Agricultural Scien
3、ces/The Animal Embryonic Engineering and Molecular Breeding Key Laboratory of Hubei， Wuhan 430064， China） Abstract： In present study， we used three different types of hens， i.e.， those laying eggs with a white shell， pink shell （generated light-brown eggs） ， or brown shell，analyzed the regularity of
4、 the pigments between blood and eggshell，detected the expression of candidate genes in the organ of hens. We consider the content of protoporphyrin is the major reason of different eggshell color， a large number of protoporphyrin may produce in spleen. Maybe CPOX gene and FECH gene are the key of th
5、e protoporphyrin. But some organic anion transporting polypeptide family members do not have a significant effect as they play in biliverdin deposition. Key words： eggshell color； protoporphyrin； candidate genes； Jianghan chicken 江?h 鸡是湖北江汉平原特有的地方品种，具有黄鸡的普遍特征，产粉壳或绿壳蛋，受到湖北及周边省份群众的广泛欢迎。消费者对于绿壳和粉壳鸡蛋的偏好
6、，使研究鸡蛋壳颜色具有重要的经济意义。众多的研究表明，造成禽类蛋壳颜色不同的直接原因就是蛋壳表面各种色素的含量不同，这些色素主要是原卟啉、胆绿素和胆绿素的锌螯合物1，2。鸡蛋的蛋壳颜色是可遗传的，且遗传力较高，一般在 0.4 左右。虽然遗传力较高，但不同品种间甚至同一品种不同个体间所呈现的表型变异却很大3-6。 在大多数后生动物中，-氨基乙酰丙酸通过高度保守的八步反应合成血红素，这一过程也称为谢明氏循环。血红素生物合成的起始是甘氨酸和琥珀酰辅酶 A 在 5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS）的作用下合成 -氨基乙酰丙酸（ALA） ； ALA 在 5-氨基乙酰丙酸聚合酶（ALAD ）的作用下聚合形成
7、胆色素原（PBG） ；PBG 在羟甲基胆素合成酶（HMBS/PBGD）的作用下合成羟甲基胆素（Hydroxymethylbilane） ；羟甲基胆素在尿卟啉原合成酶（UROS）作用下合成尿卟啉原（Uroporphyrinogen ） ；尿卟啉原在尿卟啉原脱羧酶（UROD）作用下生成粪卟啉原（Coproporphyrinogen ） ；粪卟啉原在粪卟啉原氧化酶（CPOX）作用下合成原卟啉原（Protoporphyrinogen ） ；原卟啉原在原卟啉原氧化酶（PPOX）作用下生成原卟啉（Protoporphyrin ） ；原卟啉在亚铁螯合酶（FECH）的作用下与 Fe2+结合最终形成血红素。在红
8、细胞分化过程中，CPOX 是血红素形成的限速酶。 研究发现，绿壳蛋鸡的蛋壳颜色是由一个主效基因决定的。Punnett 等7发现并认为鸡 1 号染色体上的一个呈显性的绿壳基因（Oocyan，O ）作用导致了绿色蛋壳。Bartlett等8将该基因（O）定位在鸡 1 号染色体的短臂上，发现其与内源病毒因子（ALEV1）以及豆冠位点（P ）连锁，它们之间的遗传距离分别为 1.8 cM（ev1 与 O 之间）和 4.1 cM（P 与 O 之间） 。Wang 等9研究发现有机阴离子转运蛋白家族成员 SLCO1B3 与胆绿素在蛋壳上的沉积密切相关，SLCO1B3 基因就是决定鸡产绿壳蛋的关键基因。 但是关于
9、褐壳（粉壳）鸡蛋的关键控制基因的研究较少，尤其地方土鸡的蛋壳颜色比褐壳白壳杂交后代更均匀这一现象值得深入探讨。为此，本研究在国家产业技术体系的支持下，选择白来航、江汉鸡、洛岛红等蛋鸡品种，开展关于江汉鸡蛋壳颜色的相关研究，以期为更好地研究蛋壳颜色的形成机制提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验鸡共分 3 组：白来航蛋鸡（白壳蛋） 、洛岛红蛋鸡（褐壳蛋） 、江汉鸡（粉壳蛋） ，每组选取产蛋鸡 30 只。每只蛋鸡收集 3 枚所产蛋，翅静脉采血 1 mL，每 1 mL 血液用 20 U 肝素抗凝。每组选取蛋壳颜色均一的 3 只母鸡，屠宰后取子宫内壁组织样品，于 -80 保存。所有蛋鸡均为
10、40 周龄，饲养条件良好，无疾病发生，饲料中均未添加色素成分。 1.2 试验方法 1）鸡蛋反光值测定。使用分光测色计测定各组鸡蛋的反光值，记录相关数据。 2）原卟啉与胆绿素标准曲线的制作。取 0.36 g 原卟啉标准品和 0.26 g 胆绿素标准品，分别溶于溶解液（V 浓盐酸V 甲醇=12）中，振荡混匀，避光溶解 12 h，得到标准品原液；将原液倍比稀释后用紫外分光光度计在 412 nm和 670 nm 处测定各浓度标准品的吸光值，制作原卟啉和胆绿素的标准曲线。 3）蛋壳中色素含量的测定。采用 Ito 等10 的方法，蛋壳烘干后取 0.25 g 溶于溶解液中，静止溶解 12 h，12 000
11、r/min 离心 45 min，紫外分光光度计在 412 nm 和 670 nm 处测定吸光值，比照标准曲线，获得蛋壳中原卟啉和胆绿素的含量。 4）红细胞中游离原卟啉含量的?y 定。每 20 L 抗凝血中添加 0.1 mL 生理盐水、4 mL 乙酸乙酯-冰醋酸混合液、2.5%硅藻土 0.15 mL；将得到的混合液涡旋振荡至充分混匀；高速离心 10 min 后取 3 mL 上清液，加入 4 mL 0.5 mol/L 的盐酸，混合 5 min 后取下层盐酸溶液，测定吸光度；另取0.03 mL 抗凝血测定每个血样的红细胞体积；计算每单位红细胞中游离原卟啉的相对含量。 5）RT-PCR 检测。运用 R
12、T-PCR 方法检测血红素合成通路基因 CPOX、FECH 和有机阴离子转运家族 SLCO1B3及其同家族基因 LOC418189 在不同蛋壳颜色蛋鸡子宫中的表达情况。 2 结果与分析 从表 1 可以看出，从表观上选取的白色、粉色、褐色鸡蛋，其蛋壳反光值具有极显著差异（P0.01） 。蛋壳中色素原卟啉的含量和总量在 3 种鸡蛋中差异显著（P0.05） ，且差异表现为从白壳蛋到褐壳蛋原卟啉含量逐渐增多；白壳蛋蛋壳中胆绿素的含量和总量均显著低于粉壳蛋和褐壳蛋（P0.05） ；3 种颜色蛋壳中色素总量差异极显著（P0.01） ，其差异趋势表现为色素总含量随着蛋壳颜色的加深而逐渐增多。白壳蛋鸡红细胞中
13、游离的原卟啉含量极显著低于粉壳蛋鸡和褐壳蛋鸡（P0.01） ，粉壳蛋鸡红细胞中游离的原卟啉含量与褐壳蛋鸡红细胞中游离的原卟啉含量无显著差异，但 3 种蛋鸡体内红细胞中游离的原卟啉含量呈现出随着蛋壳颜色的加深增多的趋势。 从表 2 可以看出，蛋壳的反光值与蛋壳中原卟啉含量、蛋壳中原卟啉总量和色素总量都呈极显著负相关；反光值与蛋壳中胆绿素含量以及胆绿素的总量无显著相关性。说明在褐色鸡蛋（包括粉色和褐色两种）中，决定蛋壳颜色的主要色素是原卟啉。 从图 1 和图 2 可以看出，白壳蛋鸡肝脏和脾脏中的CPOX mRNA 表达量显著低于粉壳蛋鸡和褐壳蛋鸡， CPOX mRNA 在 3 种蛋鸡子宫部的表达量
14、差异不显著。白壳蛋鸡脾脏中 FECH mRNA 的表达量显著高于其他母鸡的脾脏，FECH mRNA 在 3 种蛋鸡肝脏和子宫中的表达差异不显著。CPOX 和 FECH 作为血红素合成通路的上下游关键酶，其在脾脏中的表达结果与蛋壳颜色的变化趋势相符合，证明了蛋壳表面的色素原卟啉是来自于血红素合成通路，脾脏可能是作为蛋壳表面原卟啉来源的一个关键组织，CPOX和 FECH 基因可能是原卟啉合成暨导致蛋壳表面颜色差异的关键基因。SLCO1B3 和 LOC418189 基因在不同蛋鸡的子宫部位不存在明显的表达差异，对照蛋鸡绿壳基因的相关研究结果，认为在胆绿素沉积过程中起关键作用的SLCO1B3 基因对于
15、原卟啉的沉积不存在积极作用。 3 小结 试验结果表明，血液是蛋壳中色素的来源之一，但也可能有其他色素来源，且不同蛋鸡其色素在细胞内和细胞间转移过程的不同可能是影响蛋壳色素含量的重要原因。为此，为进一步研究蛋壳颜色提出了两个假设：褐壳（粉壳）蛋鸡相对于白壳蛋鸡，蛋壳色素的主要差异来源于鸡体内原卟啉生成量的差异；原卟啉在蛋壳腺上的沉积与胆绿素不同；蛋壳表面的原卟啉主要来源可能与脾脏有关，CPOX 和 FECH 基因可作为进一步研究蛋壳颜色的关键基因。 参考文献： 1 LANG M R，WELLS J W. A Review of eggshell pigmentationJ.Worlds Poul
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