1、广州鸿琪光学仪器科技有限公司 1 降钙素原（ PCT）检测试剂盒 （胶体金法） 主要生产工艺及反应体系的研究资料 胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一。广州鸿琪光学科技有限公司结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了 降钙素原（ PCT）定量检测试剂盒 （胶体金法），结合 鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪 对血清、血浆和全血标本中的降钙素原（ PCT）进行定量检测。 一、 反应原理描述 人降钙素原（ PCT）检测试剂（胶体金法） 是一种不需要任何仪器设备的全血 /血清 /血浆检测法，采用胶体金免疫层析技术， 试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维 上的胶体金标记的抗 PC
2、T单克隆抗体 (mAb1)以及固定于膜上测试区（ T）的抗 PCT单克隆抗体 (mAb2)和质控区（ C）的相应抗体。 测试时，将标本滴入试剂盒加样孔（ S）内 , 标本中如含有 人降钙素原（ PCT） ，则标本中的 人降钙素原（ PCT） 分别与预先包被在玻璃纤维上的抗 PCT单克隆抗体 (mAb1)结合，结合物在毛细效应下向上层析，随后会被固定在膜上相应测试区的抗 PCT单克隆抗体 (mAb2)结合捕获，从而在相应测试区出现紫红色条带。如是阴性标本，则相应测试区内将没有紫红色条带出现。无论标本中是否存在 人降钙素原（ PCT） ，一条紫红色条带都会出现在质控区（ C）内。质控区（ C）内所
3、显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。通过金标免疫分析仪检测测试区（ T）显色深度，再经过保存在卡壳上二维码上的定标曲线计算得到检测结果。 胶体金标记的基本原理是 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合 ， 由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金标记所用的主要原辅料有： 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)、氯金酸、柠檬酸三钠，玻璃纤维。 NC 膜包被的基本原 理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合，然后靠 H 键和疏水作用维持长时间结合。 NC 膜包被所用的主要原辅料有：硝酸素纤维膜、
4、抗 PCT 单克隆抗体 (mAb2)和 羊抗鼠 IgG。 二、主要生产工艺的各主要工序流程图 蓝色工序在 10 万级洁净区内进行，其他工序在普通生产区。 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 2 Yes Yes Yes NO 领 料 标记 晾 干 入 库 喷 金 入 库 半成品检验 配包被溶液 配标记用液体 稀释金标交联溶液 包 膜 配包被用液体 不合格 品控制 半成品检 验 No 不合格品控制 干 燥 组 装 NO o 放 行 成品检验 不合格品控制 总 装 定 标 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 3 三、主要工序所用主要原辅料、具体步骤即每一步骤的具体实现方法 该产品的 生产 工艺 包括各种工作溶液
5、的配置 ， 胶体金标记物、包被抗原或抗体等 浓度确定 ， 胶体金标记 物制备 ，检测线及质控线的制备等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合 产品质量标准 。 （一） 各种工作溶液的配置 1 配标记用液体： 胶体金制备： 0.01%氯金酸（ HAuCl4），水溶液 100ml 加热至沸腾，加入 1%柠檬酸三钠1ml，混匀，煮沸 5 分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却即可。 2 配金标记物干燥基础液 包被缓冲液为 10mM Tris-HCl， 1.0%BSA, 0.01% NaN3， 2%蔗糖。 3 配包被用液体 包被缓冲液为 10mM Tris-HCl， 2
6、%蔗糖。 4 配包被溶液 对照线包被羊抗鼠 IgG,包被浓度 1.0mg/ml 检测线分别包被 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb2)，包被浓度均为 1.0mg/ml 喷量 1.0 l/cm， 电机速度 511HZ。 （二） 胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定 1、 胶体金标记物 ：分别以 20ug/ml 最终浓度将 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)加入胶体金溶液中进行标记。 2、检测线包被抗原浓度： 用包被缓冲液稀释 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb2)，终浓度均为1.0mg/ml。 3、对照线包被浓度：用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG，终浓 度为 1.0mg/ml。 （三） 胶体金标记
7、物的制备 采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金， 选择 30nm 胶体金颗粒 用于标记，分别 以 20g/ml最终浓度 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)加入胶体金溶液中。快速搅拌 1 分钟，再慢速搅拌 15 分钟。分别加入 20%BSA，搅拌 5 分钟，离心 6 分钟（ 4000 转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液（原胶体金溶液体积的 1/10）重新悬浮。 置 2-8 保存，在规定的保存期内使用。 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 4 以金标记物干燥基础液对金标 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)进行按一定比例稀释， 然后 利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量 1.0 l/cm，喷笔口径为 10m
8、m， 将喷好的玻璃纤维放置烘房中， 37 2， 干燥 24 小时 。 （四） 检测线及质控线的制备 取 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb2)终浓度分别为 1.0mg/ml， 喷量 1.0 l/cm， 电机速度 511 在硝酸纤维素膜上制备检测线 ，室温干燥； 取已确定使用的 用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG，终浓度为 1.0mg/ml，用同样方法 制备 控制 线 。检测线与控制线 在 NC 膜上 之间的距离约3.5+0.5mm，线的宽度约 0.8-1.0mm； 前后均匀； 并 置温度 15 26；温度 30%；干燥 24小时以上。 （五） 半成品 检验 按批号抽取 一定 数量的半成品 检测， 对
9、所抽样的半成品 做准确性 、 最低检出量、线性、精密性、稳定性 等性能方面的检测，应符合质量标准 。 （ 六 ）贴 板 、切 条 、 装卡 在 温度 15 30；湿度 25%条件下， 将标记好的玻璃纤维、硝酸纤维膜、 聚纸板、吸水纸、 样品垫（经特殊处理，可过滤红细胞） 等物组装，要求材料附着牢固，膜条切割应宽为 4.0 1.0mm，然后装塑料壳。 （七 ） 定标 利用公司内部校准品对试剂进行定标，定标曲线保存到二维码中。 (八 )组装 1）把二维码贴到试剂卡壳上，并将干燥剂、吸管等装入 铝箔袋，封口。 2）装盒。 （九）成品检验 成品 做准确性 、 最低检出量、线性、精密性、稳定性 等性能方
10、面的检测，应符合质量标准 。 四、主要工艺的确定 1 检测线包被浓度 试验设计：固定加液量（ 喷量 1.0 l/cm， 电机速度 511HZ），用包被缓冲液调整 抗 PCT单克隆抗体 (mAb2)的包被浓度分别为 0.3 mg/ml、 0.5 mg/ml、 1.0 mg/ ml、 2.0 mg/ ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以 降钙素原 最低检出量参考品 0.1ng/ml和零浓度参考品 加样测试， 每个浓度参考品平行测试 20 次 。 计算零浓度参考品测试的吸光广州鸿琪光学仪器科技有限公司 5 值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD，计算 0.1ng/ml
11、参考品的测试平均值为 M1， 若M1M0+2SD，表明最低检测限 0.1ng/ml（ 95%置信区间） 。 试验结果： 包被浓度 M0+2SD M1 0.3mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml 2.0mg/ml 2.5mg/ml 结论：当包被浓度分别达到 1.0mg/ml， 最低检测限 0.1ng/ml，而进一步提高包被浓度，这个项目的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检 测线包被浓度均为 1.0 mg/ml。 2 对照线包被浓度 试验设计：固定加液量（ 喷量 1.0 l/cm， 电机速度 511HZ），用包被缓冲液调整羊抗鼠 IgG 抗体浓度为 0.4 mg/ml、 0.8 m
12、g/ml、 1.0 mg/ml、 1.4 mg/ml、 1.8mg/ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色时间。 试验结果： 羊抗鼠 IgG 对照线显色时间 0.5mg/ml 超过 4 min 0.8mg/ml 超过 4 min 1.0mg/ml 2min 1.5mg/ml 2min 2.0mg/ml 2min 结论：包被浓度达到 1.0mg/ml， 对照线即在 2 min 内清晰可辩，符合设计要求。最终确定对照线包被浓度 1.0mg/ml。 3 胶体金标记 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)的制备 3.1 胶体金与标记蛋白用量之比的确定
13、 试验设计： 将胶体金分装 15 管，每管 1ml，每个项目 5 管 。将 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)分别 以 5g/ml、 10g/ml、 20g/ml、 30g/ml、 40g/ml 浓度 加入上列胶 体金 溶液中， 快速 搅广州鸿琪光学仪器科技有限公司 6 拌 1 分钟，再慢速搅拌 15 分钟。加 20%BSA，搅拌 5 分钟，离心 6 分钟（ 10000 转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。 以金标记物干燥基础液对金标 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)进行按一定比例稀释， 然后 利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量 1.0 l/cm，喷笔口径为 10mm， 将喷好
14、的玻璃纤维放置烘房中， 37 2， 干燥 24 小时 。按正常生产工艺组装试剂条。 分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以 降钙素原 最低检出量参考品0.1ng/ml 和零浓度参考品 加样测试， 每个浓度参考品平行测试 20 次。 计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差 SD，计算 0.1ng/ml参考品的测试平均 M1，若 M1M0+2SD，表明最低检测限 0.1ng/ml（ 95%置信区间） 。 比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。 包被浓度 M0+2SD M1 0.3mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml 2.0mg/ml 2.5mg/ml
15、 结论：当标记浓度分别达到 20g /ml, 试剂盒 能满足 最低检出量参考品 0.1ng/ml 检出要求，而进一步提高包被浓度，这三个项目的检测线显 色程度没有明显的改变。最终确定标记浓度均为 20g /ml。 3.2 金标 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)稀释浓度的确定 试验设计：将 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)用金标记物干燥基础液按 1： 1、 1： 2、 1： 3 比例进行稀释，稀释好后按固定喷金参数，将金标 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)喷在 玻璃纤维上，干燥，按正常生产工艺组装试剂条， 分别以 降钙素原 最低检出量参考品 0.1ng/ml 和零浓度参考品 加样测试
16、，每个浓度参考品平行测试 20 次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差SD，计算 0.1ng/ml 参考品的测试平均 M1， 若 M1M0+2SD，表明最低检测限 0.1ng/ml（95%置信区间） 。比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。 稀释 浓度 M0+2SD M1 1:1 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 7 1:2 1:3 结论：只有当稀释度达到 1： 1 时， 最低检测限 0.1ng/ml，符合设计要求。最终确定金标单抗稀释度为 1： 1。 4 设计定型 通过以上实验，我们确定采用的生产工艺为： （ 1） NC 膜包被： 检测线：用包被缓冲液稀释 抗 PCT
17、 单克隆抗体 (mAb2)到 终浓度为 1.0mg/ml。 对照线：用包被缓冲液稀释羊抗鼠 IgG，终 浓度为 1.0mg/ml。 包膜参数： 喷量 1.0 l/cm， 电机速度 511HZ。 将包被好的 NC 膜放置烘房中， 37 2， 干燥 24 小时。 （ 2） 胶体金标记： 以 20g/ml 最终浓度将 抗 PCT 单克隆抗体 (mAb1)加入胶体金中。 快速 搅拌 1 分钟，再慢速搅拌 15 分钟。加 20%BSA，搅拌 5 分钟，离心 6 分钟（ 4000 转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。然后用金标记物干燥基础液分别按 1： 1 进行稀释，然后 利用喷金仪喷到玻璃
18、纤维上，喷量 1.0 l/cm，喷笔口径为 10mm， 将喷好的玻璃纤维放置烘房中，37 2， 干燥 24 小时 。按正常生产工艺组装试剂条。 成品检验 ：组装成的试剂条是否在 15 分钟内检出 降钙素原 最低检出量参考品 0.1ng/ml。 成品检验结果： 组装成的试剂条能在 15 分钟内检出 降钙素原 最低检出量参考品 0.1ng/ml。 结论：该生产工艺生产出来的试剂条符合我们的产品要求，确认为以后采用的生产工艺。 五、质控标准及内部质控品的确立 1. 企业标准的制定的缘由 由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准，我们参考已上市的人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标，设计
19、了本品的企业内部 标准， 制定了内部校准品和质控品 。 2.质控标准 2.1 准确性标准： 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 8 取 PCT 零浓度参考品，作为基础样本，将其等体积分为 4 份，在任意 3 份中添加 PCT纯分析物，使加入浓度分别为 5ng/ml、 15ng/ml、 40ng/ml，制成 3 份回收样本，分别计算其回收率，然后计算平均回收率，平均回收率应 95%。 2.2 最低检测限标准 分别以 降钙素原 最低检出量参考品 0.1ng/ml 和零浓度参考品 加样测试，每个浓度参考品平行测试 20 次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为 M0 及计算它们的标准差SD，计算 0.
20、1ng/ml 参考品 的测试平均 M1， 若 M1M0+2SD，表明最低检测限 0.1ng/ml（95%置信区间） 。 最低检测限必须 0.1ng/ml。 2.3 线性标准 用 50ng/ml 的高浓度参考品和 0.1ng/ml 的低浓度参考品，混合成 8 个稀释浓度（ Xi），每个浓度测定 3 次，分别求出检测结果均值即为实测值（ Yi）。以稀释浓度（ Xi）为自变量，以检测结果实测值（ Yi）为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（ r）及线性相对偏差，要求线性相关系数 r 0.975， 线性相对偏差不超过 15% 。 2.4 精密性标准 批内：用同一批 次试剂盒分别对企业内部
21、1ng/ml 和 40ng/ml PCT 参考品进行检测，各平行测定 10 次，批内变异系数 CV 15%。 批间：取三个不同批次的产品，分别测定企业内部 1ng/ml 和 40ng/ml PCT 参考品 ， 每个批号重复检测 10 次，批间变异系数 CV 20%。 3. 内部质控品的制备 3.1 最低检出量质控品的制备和验证 3.1.1 降钙素原 零浓度质控品的制备和验证 制备方法： 10 份经 确认 PCT 为阴性、无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜颗粒， HIV 抗体、HBV 抗原、 HCV 抗体检测均为阴性的血清标本，进行混合。经 离心、过滤等处理后，然后经罗氏诊断产品 (上海 )有限公司
22、的 降钙素原检测试剂盒 (电化学发光法 )进行检测 ,确认 PCT 浓度为 0ng/ml， 加 2/万叠氮钠， 分装标识后， -20或以下温度保存，有效期 2 年。 验证方法：将 降钙素原零浓度 质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒（胶体金法）上加样检测，要求检测结果为 0.1ng/ml，说明该质控标本可以作为本试剂盒的 零浓度 质控品。 3.1.2 降钙素原定值质控品的制备和验证 从 Hytest 公司购买 PCT 纯化品 ，用零浓度参考品作为基础液进行稀释，稀释到一系列浓度，经 罗氏诊断产品 (上海 )有限公司 的 降钙素原检测试剂盒 (电化学发光法 )检测 ,确认广州鸿琪光学仪器科技有限公
23、司 9 PCT 浓度分别 0.5ng/ml、 25ng/ml、 50ng/ml、 100 ng/ml 和 120ng/ml。 加 2/万叠氮钠， 分装标识后， -20或以下温度保存，有效期 3 年。 验证方法：将 降钙素原零浓度 质控品按说明书于降钙素原检测试剂盒（胶体金法）上加样检测，检测结果与靶值偏差 15%，说明上述质控品可以作为本试剂盒的定值质控品。 3.2 内部校准品的制备及溯源 见附件 1 降钙素原公司内部校准品的溯源过程及定值可靠性验证 六、样本要求 全血 /血清 /血浆 标本 应收集在洁净、干燥不含有任何防腐剂的塑料和玻璃容器中，全血 /血浆样本对临床常用抗凝剂（ EDTA、肝素钠、枸橼酸钠）无要求。 7 天内，可保存于 2-8冷藏，长期保存需冷冻于 -20，忌反复冻融。
