双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用.doc

1、双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用 摘 要 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的 2 个片段，这 2 个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光。 BiFC 方法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光片段种类较多，被广泛地应用到不同的细胞中，既可以检测蛋白之间的相互作用，也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外， BiFC 还能在蛋白构型的确定以及 RNA 的检测方面发挥作用。经过若干年的发展，双色荧光互补技术已经发展成包括

2、多色荧光互补技术， BiFC 和 FRET联用技术以及 BiFC和 YTH联用技术在内的多种技术，拓宽了 BiFC的应用。 关键词 ： 双分子荧光互补技术 ； 蛋白质片段互补 ； 荧光蛋白 ； 蛋白质相互作用 蛋白质之间的相互作用 (Protein-protein interactions， PPIs)形成了细胞中的调节网络，用来调控细胞的许多功能。因此，研究蛋白之间的相互作用对于深入了解许多生命过程具有非常重要的意义。迄今为止，已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白 与蛋白之间的相互作用，如酵母双杂交技术 (Yeast two-hybrid, YTH)，荧光共振能量迁移 (Fluorescen

3、ce resonance energy transfer, FRET)和蛋白片段互补技术 (Protein fragment complementations, PFCs)等方法 (表 1)。在蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术 (Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于观察直观，检测方便以及能实现在活细胞中对相互作用蛋白可视化等诸 多优点，自从其被开发出来后，便得到了广泛地应用。 1 双分子荧光互补技术的提出及理论依据 BiFC 技术本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的 N

4、-和 C-末端 2 个多肽片段。将这 2 个荧光蛋白片段分别连接到 1 对能发生相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这 2 个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的 2 个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光 1(图 1)。目前用于 BiFC 技术的荧光蛋白包括 GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白 )2， YFP(Yellow fluorescent protein，黄色荧光蛋白 )3， CFP(Cyan fluorescent protein，青色荧光蛋白 )1， BFP(Blue fluor

5、escent protein，蓝色荧光蛋白 )4和 RFP(Red fluorescent protein，红色荧光蛋白 )5等。 最先将荧光蛋白用于蛋白互补实验的是 Ghosh 等人 2。 2002 年 Hu 等人在此基础上首次提出了 BiFC 这个概念。他们 将 1 个 GFP 的突变子增强型黄色荧光蛋白 (EYFP)从不同位点切开，用 1 组相互作用的同向平行的亮氨酸拉链 (多肽 bFos 和 bJun)融合到切开的 YFP 蛋白的 N 片段和 C 片段，分别在大肠杆菌中共表达不同组合的融合多肽。他们发现，当EYFP 从氨基酸 Ala154-Asp155 间切时所构建的 1 组融合多肽，

6、能够在细菌细胞中产生 YFP的荧光。他们将这个技术称之为 BiFC，并对 BiFC 的相关性质以及影响因素进行了详细的讨论。这篇文章的发表标志着 BiFC 作为一种可视化观察蛋白质相互作用的技术被正式建立起来 3。自此，不同的荧光 蛋白突变体被运用到 BiFC 系统中用来提高荧光强度、增加荧光颜色或减少背景荧光等 (表 2)。 从 BiFC 的原理可以看出，构成 BiFC 技术的三大理论依据分别是蛋白质剪接 (Protein splicing)机制的发现，蛋白质片段互补技术 (Protein fragment complementation)的提出以及绿色荧光蛋白结构与功能的解析。 2 双分子

7、荧光互补技术 (BiFC)的特点 2.1 可视化 可视化是 BiFC 技术最大的特点。在此技术中，荧光蛋白由于相互靠近而重新构成能发出荧光的蛋白，这种荧光是自我催 化的结果，不需要底物与辅助因子，非常稳定，而且通过荧光显微镜和流式细胞仪等常规仪器很容易检测到 BiFC 信号，这种直观性使得 BiFC技术在短短几年迅速获得应用，已经成为检测活体细胞中蛋白质相互作用的一种常规方法。这种可视性既可以直观地观察到蛋白的相互作用，而且还能通过对这种可视化的荧光进行定量从而确定蛋白相互作用的强弱，极大地方便了蛋白相互作用之间的研究。 2002 年Hu 等 3首次在动物活细胞中运用 GFP 及其突变体研究蛋

8、白与蛋白间的相互作用。他们鉴定了 7 个 BiFC 复合体 (BN173/CC155， CN155/CC155， CN173/CC155， GN173/CC155，YN154/YC155， YN173/YC155 和 YN173/YC173)，观察显示蓝色、蓝绿色、绿色和黄色荧光。 Lee7等将 Venus 和 Cerulean 荧光蛋白片段在活细胞中混合可在不同位置观察到不同颜色的荧光出现。 2.2 可以应用到不同的宿主细胞中 荧光蛋白结构稳定，能在非厌氧条件下的几乎所有细胞中表达，这种稳定性极大地拓宽了荧光蛋白的应用范围。迄今为止，各种 BiFC 系统已经被成功用于不同宿主细胞中，包括动物

9、 12，植物 5，真菌 10,13和细菌 3中 ； 除了体内， BiFC 技术还能应用于体外试验中2-3。 Hoff10利用 BiFC 技术分析来自丝状真菌 (Acremonium chrysogenum)活细胞中复制因子AcFKH1 和 CPCR1 之间的蛋白与蛋白相互作用。 Hu 等人最初进行 BiFC实验选择的便是大肠杆菌 3。 Yang 等 12通过改变哺乳动物的表达密码子可以有效改善 GFP 在真核生物中的表达亮度。目前报道在活细胞内运用 BiFC研究 G蛋白 (异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 )信号传导过程中核心部件蛋白间相互作用 13。 2.3 荧光蛋白片段种类多 在众多的蛋白片

10、段互补技术中，双分子荧光互补技术中可选择的互补蛋白片段更多，主要体现在如下 3 方面。首先，荧光蛋白自身种类多，绿色荧光蛋白通过突变，可以形成激发波长不一样的荧光蛋白，如 YFP， BFP， CFP 和 RFP 等 ； 其次，同一种荧光蛋白可以在不同位置剪切成能进行功能互补的荧光片段 ； 第三，不同的荧光片段之间可以进行功能互补。互补的荧光片段种类多，使得通过荧光互补技术在同一细胞中观察多个蛋白的相互作用成为可能 1。 BiFC 系统中运用较多的为 YFP。其突变体 Citrine 和 Venus 能改善 YFP 突变体的附加氨基酸交换，可增强荧光蛋白的明亮度和折叠程度。 BiFC 的特殊地方

11、体现在如果蛋白高度集中表达甚至它们没有特定的亲和力，也可能观察到非特异性相互作用 15。 2.4 BiFC系统对温度敏感 BiFC 技术的最大缺陷是多个 BiFC 系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在 30 以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素。目前，只有基于Venus、 Citrine和 Cerulean 的 3 个双分子荧光互补系统可以在生 理温度条件下实现片段互补8。此外， BiFC 系统需要 2 个荧光蛋白片段互补，重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程，不同的 BiFC

12、系统往往需要几分钟到几小时完成该过程，因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程。 Zhang 等 16利用远红荧光蛋白 (mKate)的 BiFC 系统对肿瘤和神经疾病相关的蛋白质进行了研究。这种远红外蛋白可在 37 的生理温度下发生相互作用。 2.5 BiFC复合物的形成过程可逆 最初的研究表明，荧光蛋白分子通过 蛋白互补，形成的 BiFC 复合物不可逆 1,3-4，然而， Sung 等人的实验却表明， BiFC 复合物的形成是可逆的。在研究 Pho2 和 Pho4 相互作用时， Sung 等分别将 Pho2 和 Pho4 与黄

13、色荧光蛋白突变体 Venus 的两个荧光片段成 2 个融合蛋白，当含有这 2 个融合蛋白的酿酒酵母二倍体细胞从不含磷酸盐的培养集中转移到含高浓度磷酸盐的培养基中时， BiFC荧光消失，然而当该细胞重新恢复磷酸盐饥饿时， BiFC信号重新出现 13。这种特点使得通过 BiFC 技术来研究蛋白相互作用的动态变化成为可能。 2.6 通过定点突变可 有效减少假阳性结果的出现 在实验中，一些阴性对照的信号在检测蛋白与蛋白相互作用中较高，这将造成假阳性结果。可能的原因是最初分开的 2 个无荧光的片段具有内在的亲和力，导致无特定相互作用的自发组装。由于这个局限， BiFC 的高灵敏度、时空分辨率和准确性受到

14、质疑。研究表明通过定点缺失和定点突变改变蛋白相互作用可有效减少假阳性结果的出现。目前报道的利用分割超折叠的 GFP(sfGFP)来构建 BiFC6。将 sfGFP 从 214 和 215 氨基酸之间分开(sfGFPN:1-214 氨基酸 ;sfGFPC:215-229 氨基酸 )，将 sfGFPN 和 sfGFPC 分别与目标蛋白融合。由于 sfGFPC 的 N 端存在两个调控氨基酸残基 R215 和 D216，将其通过缺失突变后，发现可有效减少阴性信号的调节。 Lin 等 17利用在 Venus 中对 BiFC 片段进行 1 个点突变(V150L)能有效减少 BiFC的背景荧光。 3 双分子

15、荧光互补技术的应用 3.1 亚细胞定位 BiFC 尤为适合蛋白复合物的亚细胞定位 。 利用 BiFC 能够获取活细胞中蛋白质相互作用复合物的亚细胞定位信息 ， 从而为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的基础信息 。Hu 等人在活细胞中用 BIFC分析了包 含 bzip 结构域的 Jun 和 Fos 的互作及其定位情况，以及 bzip 和 Rel 家族的互作和信号系统对它们的作用和定位调节 。 结果发现 bzip 外区决定了蛋白作用位置，跨家族的相互作用影响了它们的定位和转录活性调节 18。 CD99 是一种表面糖蛋白、白细胞抗原，并且不属于已知的任何蛋白家族 Gowoon Choi 等人利用

16、BiFC 证明了 CD99 能形成同源二聚体，并且还将互作定位在细胞核的周围区域 。 3.2 转录因子间的互作研究 BiFC 已经用于许多结构类别的转录因子之间的互作研究 .这些研究使我们对核内蛋白互作及其亚核定位的 理解更为精细，还可能为我们理解核功能的区室化提供重要线索 .转录因子 Mstl属于基本螺旋一环一螺旋家族 (bHLH)的成员，在胰腺腺泡细胞中表达，对胰腺外分泌功能有重要的作用 .Zhu L.Q 等发现 MstlYN、 Mstl 一 YC 能形成荧光，而 bHLH 的螺旋的突变体 Msti1MH-YC 和 MstlYN 之间没有荧光 。 结果表明抑制转录因子 Mstl 同源二聚体

17、的形成将导致胰腺腺泡向腺管的化生 19。 脯氨酸脱氢酶 (ProDH)是催化脯氨酸降解的第一步 ， 是碱性亮氨酸拉链 S 族 (bZipS)转录因子 AtbZIP53 的靶基因 .Fridtjof Weltmeier 等人应用 BiFC 证明 AtbZIP53 不与本族的成员互作，而是与 bZip C 族的 AtbZIP10 强烈互作，从而调节 ProDH 的转录 。 这种异源二聚化介导的转录激活是调节转录因子活动与功能的重要机制 。 3.3 酶 -底物复合物的确定 BiFC 已经用于几种酶 -底物互作的确定，其中包括泛素连接酶、激酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子 。 在活体内确定酶的特殊性底物及其活

18、性位点可为酶新功能的发现提供重要证据 。 例如， Cengiz Ozalp 等应用 BiFC 系统研究了细胞色素 P450 单加氧酶系统，在活细胞天然 膜状态下验证了细胞色素 P450 与细胞色素 P450 还原酶的互作，并且提出了 P450 还原酶与 P450 反应中可能存在新的作用方式 20。 Blonde 等利用 BiFC 研究了酿酒酵母中泛素E3 连接酶 Grr1 和细胞分裂 M期调节因子 Hof1 的互作，而 Hof1 由 Grr1 的酶促降解是酵母胞质分裂过程中激动蛋白收缩的重要步骤 。 3.4 信号转导级联 通过 BiFC分析，实现了信号转导网络中许多信号蛋白互作的可视化 .膜连

19、蛋白 A4 是一种钙结合蛋白， Alen Piljic 等通过 BiFC 验证了与它连接的磷酸激酶催化亚基与调节亚基的互作 ，体内钙离子水平的升高会刺激膜连蛋白 A4 携带磷酸激酶的催化亚基与调节亚基从胞质、核质向胞膜、核膜转移 20。 SMAD 家族转录因子介导转化生长因子 的信号发生，通过 BiFC 分析， Remy 等阐明 SMAD3-SMAD4 复合物定位于胞核而 SMAD 与AKT/PKB(蛋白激酶 B)则阻止它向核的转移 。 3.5 蛋白复合物定位调节 BiFC还适用于蛋白互作复合物的动态研究 。 例如 HuC.D 等用 BiFC证明转录因子 JUN和 ATF2 形成的异源二聚体分

20、布在细胞质，一旦受到由胁迫激活的蛋白激酶的刺激后，将转移到胞核 18。 Niu T.K用 BiFC分析发现鸟嘌呤核苷酸交换因子 GBF1 和鸟苷酸鸟苷三磷酸酶（ GTPase） ARF1（ ADP 核糖基化因子）形成的复合物受到布雷菲德菌素胁迫将会在细胞高尔基体富集 19。 3.6 涉及转录后修饰的互作 许多蛋白互作需要特殊的转录后修饰，这类互作也可以通过 BiFC在活体内分析 Kanno等发现溴域蛋白 BRD2 有选择性的和乙酰化的组蛋白结合，这种结合不仅要求 BRD2 的溴域还要求组蛋白有乙酰化的尾部 。 Nyfeler 发现耐药相关基因 ERGIC53 受体与组织蛋白酶Z和组织蛋白酶 C

21、的互作要求 ERGIC53 的 凝集素结合结构域，这表明它们之间的互作要求配基糖基化 。 因此 BiFC能够监视转录后发生的改变蛋白互作的修饰作用 。 3.7 监视新的互作蛋白 互补分析以及特殊的酵母双杂交转录激活分析已经用来确定很多蛋白的新互作蛋白Remy 等使用 BiFC文库监视方法确定了 AKT/PKB的新的互作蛋白 Ft1 蛋白 。 以 BiFC为基础的文库监视方式其优势是能在活体内监视蛋白互作，并且能直接观察到刺激对互作的影响 。 缺点是在实验条件下蛋白表达水平的差异可能影响目的蛋白互作蛋白的确定 。 但是在特殊的细胞条件下， BiFC仍然能确定目的蛋白的互作蛋 白 。 3.8 大分

22、子复合物和分子骨架 把荧光蛋白带到一起恢复荧光活性并一定由互作蛋白直接接触发生，融合蛋白通过被大分子复合物组装带到一起也能在互作蛋白不接触的情况下产生互补荧光 。 类似地，融合蛋白和同一个大分子骨架结合，即使互作蛋白不直接接触也能产生荧光 。 比如 Rackham 等利用 BiFC分析了与 mRNA结合的人类 zipcode结合蛋白 (IMP1)和智力发育延迟蛋白 (FMPR)互作的可视化 21。 Stains 等通过 BiFC 在活体内实现了定位在寡聚核苷酸上的锌指 DNA结合蛋白同源互作的可视化 。 3.9 multicolour BiFC 研究发现由不同荧光蛋白的片段组成的双分子荧光复合

23、物和由同一种荧光蛋白片段组成复合物有不同的光谱 。 这些复合物之间的不同光谱实现了同一细胞中多种蛋白复合物之间的可视化，这就是 multicolour BiFC的原理 。 因此双分子荧光还能进行有共同互作蛋白的竞争性蛋白互作的研究 。 例如 Hu 等已用 multicolour BiFC 来确定 bZIP 结构域中 Fos、 Jun和 ATF2 转录因子形成二聚体的效率，并证明了 Fos 与 Jun 异源二聚体的形成效率远高于Fos 与 ATF2 以及 Jun 与 ATF2 异源二聚体的形 成效率 。 Grinberg 等用多色 BiFC比较了 Max与 bMyc 结构域的互作效率和 Max

24、与 Mad 家族转录因子互作效率的差异 。 多种复合物分布的直接比较不仅消除了寻找跟复合物亚细胞定位相同的标记物，还能帮助确定复合物的不同定位是定位信号所致还是复合物在细胞内的不同功能所致 。 3.10 检测泛素化途径 泛素 (ubiquitin， Ub)是含 76 个氨基酸残基的多肽，分子质量约 8.5ku，高度保守，广泛存在于各种真核细胞中 。 它的主要作用是以多聚泛素链的形式与要降解的底物蛋白结合，从而标记底物蛋白 。 Muller 等还发现一种 类泛素蛋白 SUMO，它也标记底物，但不促进其降解 。 一个或多个泛素分子在一系列酶的作用下与其他蛋白质分子共价结合就称为泛素化 。泛素化可直

25、接影响蛋白质的活性及其细胞内定位 。 细胞内许多蛋白质均可被泛素化系统识别和修饰，包括细胞表面受体、信号传导蛋白、转录因子等 。 泛素化过程是一个由多种酶参与的级联反 。 首先，在 ATP 的参与下，泛素激活酶 (E1)作用于泛素羧基端的谷氨酸残基，并将其激活 。 接着，活化了的泛素蛋白利用高能巯基键与泛素结合酶 (E2)的半胱氨酸残基结合 。 最后， E2 直接或者通过泛素连接酶 (E3)将泛素与靶蛋白 连接，从而完成泛素化的过程 。 泛素化的靶蛋白可被细胞中的 26 S 蛋白酶体识别，从而将其降解 。 目前越来越多的研究发现，泛素化系统的改变和细胞的转化与肿瘤的发生、神经退行性疾病、免疫和

26、炎症反应等有密切关系 。 BiFC 技术为泛素化途径检测提供了一种简便方法 。 Fang 等 21用 YN 标记泛素分子，YC标记泛素作用底物 Jun， pFLAG-CMV2()-YN-Ub 和 pFLAG-CMV2()-YC-Jun 共染细胞 COS-1， 37 培养 24h，再 30 培养 4 16h 后进行荧光检测 。 若出现荧光，则表明泛素结合到了底物蛋白 上，即底物蛋白被泛素化 。 经对表达 YN-Ub(带 Flag 标记 )的细胞提取物和表达 HA-Ub 的细胞提取物作蛋白质印迹分析，发现电泳后的蛋白质条带亮度和弥散情况基本相同，仅有由于 YN 分子质量较 HA 大而引起的条带稍微

27、滞后，该结果说明，在泛素分子上融合表达一段荧光蛋白不会影响泛素与其底物的结合 。 3.11 用于检测 RNA BiFC 对细胞内的 RNA可进行特异性标记。 Valencia Burton 等 22用基于 GFP 的 BiFC系统成功在大肠杆菌中标记了 mRNA和 5S 核糖体 RNA。他们将真核生物的翻译起始因子(eIF4A)切成 2 个结构域，分别与 GFP 的 2 个片段融合形成融合蛋白。 RNA 的末端连有eIF4A蛋白的 RNA适配子。将其导入细菌后，融合蛋白之间发生相互作用，蛋白表达可特异性的反应到 RNA 适配器上。 GFP 重新组成发出荧光，可以照亮连接在 eIF4A 蛋白的R

28、NA。 Ozawa等 23同样用基于 GFP 的 BiFC系统研究了真核细胞线粒体 RNA。借助双分子荧光互补技术来标记 RNA 为研究 RNA 提供了新的工具，也拓宽了 BiFC 技术的应用范围。 4 影响 BiFC实验的因素分析 在 BiFC 实验中影响因素有很多，除了宿主细胞和荧光蛋白 的种类外，还有形成融合蛋白时插入到荧光蛋白片段上的小肽和荧光蛋白的位置。 4.1 Linker 的序列 通常在荧光蛋白质片段与目标蛋白质之间加 1 个连接肽，防止由于蛋白质空间位阻导致蛋白片段间不能相互靠近现象出现。常用的连接肽氨基酸序列有 RSIAT、 RPACK-IPNDLKQKVMNH1,3和 GG

29、GGS11等。 linker 为单链结构，因此存在空间位置上的旋转灵活性，这使荧光蛋白片段更容易相互靠近发生相互作用，重新产生荧光。 4. 2 荧光蛋白片段的位置 在 BiFC 试验中，荧光蛋白片段的位置对结果的影响是 显著的。 Sung 等人在研究 Cet1的寡聚化作用时，发现将 Venus 的 VN 或 VC分别连接在 Cet1 的 C末端时，在细胞核中检测不到荧光 ； 将 VN 或 VC 分别连接在 Cet1 的 N 末端时，在细胞核中检测到了强烈的荧光，而将 VN 连接到 Cet1 的 N末端，而将 VC 连接到 Cet1 的 C末端，这样形成的 BiFC复合物信号较弱，产生的荧光强度

30、也较弱，造成这种差异的原因可能和表达的蛋白之间的拓扑约束有关。荧光片段位置的差异会导致 BiFC 实验的差异 13。这个现象被 Chandlter 等人在植物中得到了证明。为了证明 BIM1 和 DRN蛋白之间的相互作用， Chandlter 等人构建了4 个载体，即分别将 BIM1 和 DRN 融合到 YFP 的 N 末端和 C 末端，如此构建的载体分别是 ： BIM1-YFP， DRN-YFP， YFP-BIM1 和 YFP-DRN。结果发现，只有将 BIM1-YFP 和YFP-DRN 配对，才能产生 BiFC 复合物。这个实验再次表明，荧光蛋白片段位置的不同，对双分子荧光互补实验的成败起

31、着十分重要的作用 24。 5 BiFC系统的扩展 5.1 多色荧光互补技术 2003 年， Hu 等人在 BiFC 的基础上建立起了多色荧光蛋白互补技术 (Multicolor fluorescence complementation analysis)。和 BiFC 一次只能检测一组相互作用蛋白不同的是，这种技术能同时检测一个细胞中多组蛋白的相互作用。他们将 GFP、 CFP、 YFP 和BFP 分别在特定位置切开后与目标蛋白连在一起形成融合蛋白，然后将这些融合蛋白混合。不同的目标蛋白间会发生相互作用，同时使不同的互补荧光蛋白片段结合，形成多个蛋白复合体。通过荧光显微镜可观察到不同颜色的荧光

32、 1。这为研究蛋白功能奠定了一定的基础。多个 BiFC系统运用到植物中。 Lee 等 7在植物细胞 中将目标蛋白分别标记上 CFP的 C-端片段 (cCFP)， Venus 和 Cerulean 的 N-端片段 (nVenus 或 nCerulean)， cCFP 融合蛋白和 nVenus 融合蛋白发生相互作用呈现黄色荧光 ； 而 cCFP 融合蛋白和 nCerulean 融合蛋白相互作用则呈现蓝色荧光。根据发光颜色的不用来观察不同蛋白间的相互作用。 Zhang 等25在线虫中利用多色荧光研究重叠基因表达模型。 目前报道的在洋葱表皮细胞中运用多色 BiFC 研究不同蛋白间的相互作用。其片段来自

33、 GFP 及它的突变体 CFP、 YFP 和红色荧光蛋白突变体 (DsRed-Monomer)26。通过鉴定来自 CFP、 GFP、 YFP 片段的 9 个不同 BiFC复合体和一个来自 DsRed-Monomer 片段的 BiFC 复合体，结果发现 GFP 片段和 DsRed-Monomer 片段间的组合没有荧光出现。这说明不是任何的荧光蛋白片段 C-端和 N-端之间能发生相互作用。这为筛选到相互作用的荧光蛋白提供了一种可行的方法。 Waadt 等 27用同样的方法在植物细胞中呈现两个蛋白复合体(CN173/CC156 和 CN173/YC156)。通过观察西红柿中未成熟蛋白 (NR)与乙烯

34、感受器(LeCTR)间的相互作用来探究乙烯信号的传导 28，有无荧光可作为 NR-LeCTR 相互作用的指示。 5.2 BiFC和 FRET联用技术 FRET 技术要求在距离 10nm 范围内，供体发射波谱和受体激发波谱有一定程度的重叠，并且， FRET 技术需要精密的仪器并进行复杂的数据分析。这种方法检测的是供体和受体的荧光强度的变化。通过 2 个有区别的光谱 BiFC 可建立荧光共振能量转移 (FRET)。近来， Shyu29在动物细胞中将 BiFC 和 FRET 联合实现 3 个蛋白复合体同时呈现在同一细胞中，通过 CFP/YFP 与 YN173/YC155 和 Cerulean(CFP

35、 突变体 )一起 FRET 来实现，所以将来有可能实现在同一细胞内同时呈现 4 个蛋白复合体。 5.3 BiFC和 YTH联用技术 Zheng 等 30利用基于 GFP 和 YFP 的 BiFC 系统和 YTH技术联用来研究萝卜花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)中辅助蛋白酶组件 (Helper component-proteinase, HC-Pro)在酿酒酵母、植物和昆虫细胞中自我相互作用。这一研究为在特定时间和空间上控制病毒侵染提供了理论依据。 BiFC 可以弥补 YTH 技术不足的方面，例如，有些外源蛋白在酵母体内处于不同的位置，几乎没有可能发生相互作用，而

36、BiFC 技术可直接观测到细胞中蛋白质间相互作用的位置。 6 挑战与前景 蛋白互作与修饰的研究能对我们理解生物调节机制提供重大帮助 。 而在活细胞或有机体内实现蛋白互作与修饰可视化是理解研究这些机制的重要条件 。 BiFC 及以其为基础发展出来的分析方法是实现活体内蛋白互作与泛素家族结合反应可视化的重要工具 。 研究表明这些分析方法能广泛应用于许多结构、功能不同的蛋白互作与修饰的研究 。 这些分析已经用于不同的细胞株与有机体，并未发现没有它 们在任何实验材料系统出现不适用 。 现行的荧光互补技术是一种有力的实验工具，但是有些特点也限制了它的应用 。 比如荧光片段在没有连接互作蛋白时可能发生自发

37、互补，这是双分子荧光互补中的主要背景信号 。 我们可以通过连接不发生互作的蛋白来消除这种背景信号，或者给载体连接较弱的启动子减弱蛋白表达水平 。 我们下一步发展的方向是能减弱自发互补但不影响它们连有互作蛋白时互补的荧光系统，从而使系统受蛋白表达水平影响降低 。 还有荧光片段互补连接后的不可逆性，由于体内蛋白的互作是一个动态过程，蛋白 A与蛋白 B互作结束后，还可能发生蛋白 A与蛋 白 C的互作，荧光片段互补连接后的不可逆性限制了这种蛋白互作的动态学过程研究 。 另外，尽管 BiFC 不要求知道互作蛋白的结构信息，对互作蛋白间的距离和位置取向也没有特殊要求，但是空间位阻能阻止荧光片段互补的形成

38、。 因此，可在荧光片段和融合蛋白之间一段短肽连接物以消除空间位阻 。 最后， BiFC 系统的两个荧光蛋白互补片段重新形成完整的活性蛋白时，不同的 BiFC 系统需要不同的时间，从几十分钟到几小时不等 。 如果双分子荧光信号滞后于蛋白质相互作用过程 ， 就不能实时观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程 。 虽然我们发展了许多具有重 要特性的荧光蛋白突变体，但是在荧光形成的化学反应速率上并没有很大提高 。 尽管如此，我们坚信随着 BiFC 基础理论研究的深入和新的性能优异的互补片段的发掘， BiFC 将会越来越完善，它必将在蛋白质相互作用以及翻译后修饰的研究中具有更加广泛的应用前景，也必将会为

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