1、1柚寄生总黄酮的提取工艺优化及其体外抑制人肝癌细胞 Hep3B 作用的初步评价廖彭莹*，卓生华，邱志彬，蔡少芳（广西中医药大学药学院 广西 南宁 530001）摘要：目的：优选柚寄生总黄酮的提取工艺，初步评价总黄酮体外抑制人肝癌细胞 Hep3B 的作用。方法：以芦丁为对照品测定柚寄生提取液的总黄酮含量，并以此为指标采用正交试验法 L9（3 4）优选柚寄生总黄酮的提取工艺条件；采用 MTT 法测定总黄酮对人肝癌细胞 Hep3B 的体外抑制作用。结果：乙醇浓度对总黄酮的提取率影响最大，其次是料液比、提取温度、提取时间；体外抗肿瘤活性筛选结果显示，在浓度为 500 gmL-1 g/mL 时，总黄酮对
2、人肝癌细胞 Hep3B 作用后，肿瘤细胞的生长抑制率存活率为 48.6051.40%。结论：优选出的柚寄生总黄酮提取工艺条件为乙醇浓度 60，料液比 1：30（gmL -1g/mL） ，提取温度 80 ，提取时间 120 min，连续提取 2 次；柚寄生总黄酮有一定的抑制人肝癌细胞 Hep3B 的作用。关键词：柚寄生，总黄酮，提取工艺，抗肿瘤 Optimization of Extraction Process and the Preliminary Evaluation of the Inhibitory Activity on Hep3B Cancer Cell of Total Flav
3、onoids from Viscum ovalifolium DC. Liao Pengying*, Zhuo Shenghua, Qiu Zhibin, Cai ShaofangGuangxi University of Chinese Medicine, Guangxi, Nanning Abstract Objective: to optimize the extraction process of total flavonoids from Viscum ovalifolium DC. and to evaluate the inhibitory effect of total fla
4、vonoids on Hep3B cancer cell in vitro. Method: the content of total flavonoids was analyzed by UV method, using rutin as the standard substance, and the extraction process of total flavonoids was optimized by orthogonal experiment (L9(34). The inhibitory effect of the total flavonoids on Hep3B cance
5、r cell in vitro was measured by MTT method. Results: the concentration of ethanol had the greatest effect on the extraction ratio of total flavonoids, and the order of the other factors that affected the extraction process was: the ratio of solid to liquid, the extraction temperature, and the extrac
6、tion time. The impressive rate on the Hep3B cancer cell was 51.40% after being treated by total flavonoids at the concentration of 500 gmL-1. Conclusion: the optimal extraction conditions were as follows: 60% of ethanol concentration, 1:30 (gmL-1) of solid to liquid ratio, 80 C of extraction tempera
7、ture, 120 min of extraction time and extract twice. The total flavonoids showed some inhibitory effect on Hep3B cancer cell in vitro._通讯作者：廖彭莹， （1984 ） ，女，讲师，硕士。研究方向：天然药物化学。Tel ：0771-3137585，E-mail: 。基金项目：2012 年度广西高等学校立项科研项目（201204LX201) ；广西中医学院校级普通课题（P2010062）Comment t1: 进行抗肿瘤试验有临床依据吗？Comment t2:
8、进行抗肿瘤试验有临床依据吗？2the other factors that affected the extraction process was: the ratio of solid to liquid, the extraction temperature, and the extraction time. The survival rate of the Hep3B cancer cell was 48.60% after being treated by total flavonoids at the concentration of 500 g/mL. Conclusion: th
9、e optimal extraction conditions were as follows: 60% of ethanol concentration, 1:30 (g/mL) of solid to liquid ratio, 80 C of extraction temperature, 120 min of extraction time and extract twice. The total flavonoids showed some inhibitory effect on Hep3B cancer cell in vitro.Key words: Viscum ovalif
10、olium DC., total flavonoids, the extraction process, anticancerKey words: Viscum ovalifolium DC., total flavonoids, the extraction process, anticancer柚寄生，别名柚树寄生、缘柚寄生，为桑寄生科槲寄生属植物瘤果槲寄生（Viscum ovalifolium DC.）的带叶茎枝 1，主要分布于华南及云南等地 1。柚寄生是黎族和苗族常用药材，以带短段寄主的全株入药，鲜用或晒干使用 2，味苦、辛，性凉，功能主治为祛风除湿、活血止痛、化痰止咳、解毒 1。研究
11、表明柚寄生含有总黄酮类成分 3。植物总黄酮已被证实有丰富的生理活性，包括心血管系统活性、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等 4。为了更深入地认识和利用柚寄生的总黄酮类成分，本论文采用回流提取法，设计了 L9（3 4）正交试验，以提取液总黄酮含量为指标，优选柚寄生总黄酮的提取工艺，并对其体外抑制人肝癌细胞 Hep3B的作用进行了初步评价。植物总黄酮已被证实有丰富的生理活性，包括心血管系统活性、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等 4。为了更深入地认识和利用柚寄生的总黄酮类成分，本论文采用回流提取法，设计了 L9（3 4）正交试验，以提取液总黄酮含量为指标，优选柚寄生总黄酮的提取工艺条件，并对其体外抑制人肝癌细胞 Hep3
12、B的作用进行了初步评价。1. 仪器与材料电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司） 、Agilent 8453型可见- 紫外分光光度计（美国安捷伦科技有限公司） 、PowerWave XS 全波长酶标仪（Bio-tek 公司） 、比色皿、芦丁（本实验室自制，经含量测定纯度大于 98%） 、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95% 乙醇（分析纯） 、蒸馏水；柚寄生（2009 年购于玉林药材市场，由广西中医药大学韦松基教授鉴定为寄生于柚树的桑寄生科槲寄生属植物瘤果槲寄生（Viscum ovalifolium DC.）的干燥带叶茎枝。药材烘干、粉碎，过 60目筛。2. 方法与结果2.1 溶液的制备精密称量烘
13、干至恒重的芦丁对照品约 20 mg，溶于 70%乙醇中，超声溶解，定容至 100 3mL，即为对照品溶液，浓度为 0.20 mgmL-1mgmL。精密称量 1 g 药材，精密量取 70%乙醇20 mL，加热回流提取约 60 min，提取 1 次，过滤，得样品溶液。2. 2 波长的选择精密吸取对照品溶液 10 mL 及样品溶液 0.3 mL，分别置于 50 mL 容量瓶中，加 5% NaNO2溶液 2 mL，摇匀后放置 6 min，加 10% Al(NO3)3 溶液 2 mL，摇匀，再放置 6 min，加 20% NaOH 溶液 20 mL，加水定容至刻度，摇匀，放置 15 min，以试剂空白为
14、参比，采用紫外分光光度法在 400-700 nm 范围进行扫描，确定最大吸收波长。芦丁对照品溶液显色后的紫外吸收光谱最大吸收波长在 515 nm 附近，样品溶液最大吸收波长在 485 nm 附近，二者的最大吸收波长有偏差，由于本实验以芦丁对照品溶液为标准测定样品的总黄酮含量 5，故确定 515 nm 为测定波长。芦丁对照品溶液显色后的紫外吸收光谱最大吸收波长在 515 nm 附近，样品溶液最大吸收波长在 485 nm 附近，二者的最大吸收波长有偏差，由于本实验以芦丁对照品溶液为标准测定样品的总黄酮含量 5，故确定 515 nm 为测定波长。2. 3 标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品溶液 2.0
15、，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0 mL，分别置于 50 mL 容量瓶中，按“2.2”项下操作，在 515 nm 处测定吸光度，以吸光度（ A）为纵坐标，以浓度（C ）为横坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程 A = 12.411C 0.0143，相关系数 r = 0.9994，线性范围 0.008-0.056 mgmL-1mg/mL。2. 4 精密度实验精密吸取芦丁对照品溶液 10.0 mL，置于 50 mL 容量瓶中，按“2. 2”项下操作，在 515 nm处测定吸光度，重复测定 6 次，RSD 为 0.92%，表明仪器精密度良好。2. 5 稳定性实验精密吸取
16、芦丁对照品溶液 10.0 mL，置于 50 mL 容量瓶中，按“2. 2”项下操作，在 515 nm处测定吸光度，每隔 10 min 测一次，2 小时内 RSD 为 0.71%，表明对照品溶液在 2 h 内稳定性良好。2.6 重现性实验精密称取 6 份 1 g 药材，按 2.8 正交试验优化所得工艺条件进行提取，制备成 6 份样品溶液，从中分别精密吸取 0.8 mL 置于 50 mL 容量瓶中，按“2.2 ”项下操作，在 515 nm 处测定吸光度，结果见表 1。表 1 样品溶液重现性测定结果Comment t3: 工艺研究仅用总黄酮含量为指标不够，建议增加纯度指标。4样品重量/g 吸光度 平
17、均值 标准偏差 相对标准偏差/%1.000 0.3931.001 0.3961.001 0.4071.001 0.3971.001 0.3961.000 0.3930.397 0.0052 1.302.7 回收率实验精密吸取 6份已知黄酮含量的样品溶液 0.4 mL，分别置于 50 mL容量瓶中，分别精密加入0.20 mgmL-1芦丁对照品溶液 4 mL，按“2.2”项下操作，在 515 nm处测定吸光度，计算回收率、平均回收率等，结果见表 2。表 2 样品溶液加样回收率测定结果编号 样品量/mg 加样量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% 标准偏差 相对标准偏差/% 1 0.81
18、3 0.808 1.625 100.52 0.813 0.808 1.620 99.883 0.813 0.808 1.580 94.934 0.813 0.808 1.595 96.785 0.813 0.808 1.595 96.786 0.813 0.808 1.595 96.7897.61 2.13 2.18 2.6 8 正交试验设计 6, 7选择乙醇浓度（A） 、提取温度（B） 、提取时间（C ） 、料液比（D）4 个因素，每个因素选3个水平，设计 L9（3 4）正交试验，见表 13。每组试验均精密称取 1 g药材，均提取 1次，过滤得提取液，精密吸取适量提取液，置于 50 mL容量
19、瓶中，按“2. 2”项下操作，在 515 nm处测定吸光度。依据 2.3芦丁标准曲线回归方程及稀释倍数折算提取液的总黄酮含量。每个正交试验平行作 3份，总黄酮含量取平均值，结果见表 24。结果表明所考察的 4种影响因素乙醇浓度（A） 、提取温度（B） 、提取时间（C） 、料液比（D）的影响大小是 A乙醇浓度料液比 D提取温度 B提取时间 C。优化所得 的提取总黄酮的工艺条件是 A1B3C3D2，即乙醇浓度 60% ，提取温度 80 ，料液比 1:30，提取时间 2 h。表 1 3 正交试验因素水平表水平 A乙醇浓度 B提取温度（/） C提取时间（/min） D料液比1 60% 60 60 1:
20、202 70% 70 90 1:303 80% 80 120 1:40表 2 4 正交试验结果直观分析表试验号 因素 总黄酮含量Comment t4: 计算有误，该表误差项来自何处？请查阅相关文献，进行修改。5A B C D （/%）1 1 1 1 1 10.672 1 2 2 2 11.333 1 3 3 3 11.974 2 1 2 3 11.005 2 2 3 1 10.906 2 3 1 2 11.517 3 1 3 2 9.698 3 2 1 3 9.259 3 3 2 1 9.10T1 33.97 31.36 31.43 30.67T2 33.41 31.48 31.43 32.5
21、3T3 28.04 32.58 32.56 32.22K1 11.32 10.45 10.48 10.22K2 11.14 10.49 10.48 10.84K3 9.35 10.86 10.85 10.74R 1.97 0.41 0.37 0.622.7 9方差分析为验证上述直观分析的结果进一步进行方差分析，结果见表 53。取离差平方和最小项提取时间项作为误差项进行分析统计 6，结果表明乙醇浓度的影响差异显著具有显著性差异（p P FD FB FC，与直观分析的结果一致。表 3 5 正交试验结果方差分析表方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 pP值 显著性乙醇浓度（A） 6.3727.1
22、462 3.1863.57339.82525.184p0.1005* 提取温度（B） 0.3580.3012 0.1790.1512.23751.062提取时间（C） 0.1590.2842 0.07950.1420.99375-料液比（D） 0.5670.6622 0.28350.331 3.543752.333误差 0.16 2 0.08注：F 0.05 (2, 2) = 19.00。2.8 10提取次数的确定精密称量 1 g药材共 4份，按 2.8正交试验优选的提取工艺条件进行提取，分别提取 1次、2次、3 次、4 次，过滤，得提取液，取适量体积置于 50 mL容量瓶中，按“2. 2”项
23、下操作，在 515 nm处测定吸光度。依据 2.3芦丁标准曲线回归方程及稀释倍数折算提取液的总黄酮含量，6每个试验平行作 3 份，总黄酮含量取平均值，结果见表 46。结果表明随着提取次数增加，提取液总黄酮含量有所增大，但提取 3 次以上，提取液总黄酮含量反而减少，考虑操作的时间成本与能耗成本，最终确定提取次数为 2 次。 表 4 6 提取次数对总黄酮含量的影响提取次数 样品质量（/g） 总黄酮含量（/%）1 1.000 11.972 1.000 12.443 1.000 11.344 1.000 12.162.9 11 验证实验通过正交试验及提取次数的确定试验优化得到总黄酮提取工艺条件为乙醇浓
24、度 60% ，提取温度 80 ，料液比 1：30，提取时间 2 h，提取次数 2 次。精密称取 1 g 药材共 3 份，分别按此条件提取，取提取液适量体积置于 50 mL 容量瓶中，按“2.2”项下操作，在 515 nm 处测定吸光度。依据 2.3 芦丁标准曲线回归方程及稀释倍数折算提取液的总黄酮含量，结果见表 57。 ，提取液总黄酮含量平均值为 12.36%。将提取液蒸干，精密称重，计算总黄酮得率和总黄酮纯度，结果见表 8。表 5 7 验证试验结果样品质量（ /g）吸光度（A）浓度/ mgmL-1（C）总黄酮含量（/% ）平均值（/% ）标准偏差 相对标准偏差（/%）1.001 0.395
25、0.0330 12.361.001 0.393 0.0328 12.291.001 0.398 0.0332 12.4412.36 0.075 0.61表 8 总黄酮得率和总黄酮纯度结果样品质量/g 黄酮类物质质量/g提取液挥干后质量/g总黄酮得率/%总黄酮纯度/%总黄酮纯度平均值/%1.001 0.124 0.263 26.27 47.151.001 0.123 0.293 29.27 41.98 45.141.001 0.125 0.270 26.97 46.302.10 重现性实验精密称取 6 份 1 g 药材，按正交试验优化所得工艺条件进行提取，制备成 6 份样品溶液，从中分别精密吸取
26、 0.8 mL 置于 50 mL 容量瓶中，按“2.2” 项下操作，在 515 nm 处测定吸光度，Comment t5: 该部分属于方法学考察项，建议放在工艺研究前。Comment t6: 1、总黄酮纯度多少？如果纯度很低，怎么确定、药效作用？2、建议提供提取物的质量控制标准。Comment t7: 1、建议用抑瘤率为指标。2、用表格表述结果。7结果见表 6。表 6 样品溶液重现性测定结果样品重量（g）吸光度（A） 平均值 标准偏差 相对标准偏差（%）1.000 0.3931.001 0.3961.001 0.4071.001 0.3971.001 0.3961.000 0.3930.397
27、 0.0052 1.302.11 回收率实验精密吸取 6份已知黄酮含量的样品溶液 0.4 mL，分别置于 50 mL容量瓶中，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.20 mg/mL）4 mL，按“2.2”项下操作，在 515 nm处测定吸光度，计算回收率、平均回收率、RSD，结果见表 7。表 7 样品溶液加样回收率测定结果编号 样品量（mg）加样量（mg）测得量（mg）回收率（%） 平均回收率（%） 标准偏差 相对标准偏差（%）1 0.813 0.808 1.625 100.52 0.813 0.808 1.620 99.883 0.813 0.808 1.580 94.934 0.813 0.80
28、8 1.595 96.785 0.813 0.808 1.595 96.786 0.813 0.808 1.595 96.7897.61 2.13 2.18 2.1212 总黄酮的抗肿瘤活性初步评价 68取 2.11按优化工艺提取所得的将总黄酮适量，将其溶于 DMSO中，以 MTT法测定其对人肝癌细胞 Hep3B的抑制作用。将处于对数生长期的 Hep3B细胞 100 L/孔接种于 96孔微量培养板中，7.5 * 103 细胞/孔，培养 24 h后加入以培养基稀释的总黄酮溶液，使最终浓度为 500 gmL-1g/mL和 250 gmL-1 g/mL，每个浓度均为 3个复孔，另设空白对照孔。细胞在
29、 37 C、5%CO 2条件下分别培养 48 h后，去除培养基，PBS 洗 1次后，加入新鲜培养基 100 L/孔，加 MTT 5 mgmL-1 mg/mL 20 L/孔；继续培养 4 h后，去除孔中的培养基和 MTT，加入DMSO100 L/孔，立即用酶标仪测 OD 570-630值，计算肿瘤细胞存活率生长抑制率。结果表明，在浓度为 500 g/mL时，总黄酮对 Hep3B细胞的抑制作用明显，肿瘤细胞存活率为 48.60%，浓度为 250 g/mL时，总黄酮对 Hep3B细胞的抑制作用不明显。 见表 9。表 9 总黄酮对人肝癌细胞 Hep3B生长的抑制活性8编号 样品浓度/g mL-1 肿瘤
30、细胞生长抑制率/%1 250 9.652 500 51.40*表示 ANOVA 软件统计有显著差异 P 0.013. 分析与讨论本论文采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法测定柚寄生的总黄酮含量，考察了该含量测定方法的精密度、稳定性、重现性和回收率，结果均良好，不同文献关于 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法的各试剂加样量有不同的描述，本论文参照文献79进行操作。本论文采用正交试验法优选柚寄生总黄酮的提取工艺条件，经直观分析和方差分析确定优化后提取工艺条件为乙醇浓度 60% ，提取温度 80 ，料液比 1：30，提取时间 2 h，提取次数 2 次，考察的四个因素中乙醇
31、浓度的影响最明显，其他因素的影响不明显，选用回流提取法作为总黄酮的提取方法，选用乙醇作为提取溶剂，操作简便、成本低廉，所得提取液毒性小，初步满足工业生产要求。本论文对柚寄生总黄酮的体外抗肿瘤活性进行了初步评价，结果表明其对人肝癌细胞 Hep3B 有一定的体外抑制作用，为进一步揭示柚寄生药材的药效物质基础提供了一定的依据。参考文献1. 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草 M. 上海：上海科学技术出版社. 1999.2. 罗集鹏，张电光. 瘤果槲寄生的形态组织和紫外光谱鉴别 J. 中药材，2001，24（11）：797-800.3. 庞瑞媛，黎建玲 广寄生、瘤果槲寄生总黄酮含量的测定及比较
32、 J. 玉林师范学院学报，2008，29（5）：67-70.4. 徐任生主编. 天然产物化学 M. 北京：科学出版社. 第二版. 2004. 5. 李姣娟，黄克瀛，龚建良，等. 川桂叶中黄酮类化合物的提取与测定 J. 光谱实验室，2009，26（3）：530-534 .6. 熊蔚蔚，徐铭键，刘健，等. 毛樱桃总黄酮超声提取工艺优选 J. 中国实验方剂学杂志，2012,18（15）：29.7. 王幸，帅延琼，覃鸿恩，等. 多指标综合评价法优选湖北海棠叶中总黄酮提取工艺 J. 中国实验方剂学杂志，2012,18（13）：46.8. 李元圆，杨莉，王长虹，等. 草豆蔻化学成分及体外抗肿瘤作用研究 J. 上海中医药大学学报，2010，24（1）：72-75.99. 赵超，陈华国，靳凤云，等. 槐枝中总黄酮的含量测定 J. 光谱实验室，2010，27（1）：188-190.
