1、 - 1 - 注射用重组人干扰素 2b 稳定性分析 摘 要 结合本人在 某 公司实习的相关经历与心得，本文将对该公司主导产品 “注射用重组人干扰素 2b 的稳定性加以分析，并最终得出科学的结论。 关键词： 注射用重组人干扰素 2b， 稳定性 ， 分析 。 - 2 - 目 录 摘 要 1 引 言 3 第一章 注射用重组人干扰素 2b 简介 3 第一节 基因工程菌 E.coli DH 5/pUB 419 . 4 第二节 生产工艺 4 第三节 质量控制 .5 第二章 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位） 稳定性实验 6 第一节 实验目的 6 第二节 实验材料 6 第三节 实验方法 . .
2、6 第四节 结果与分析 7 第五节 结论 . .8 第三章 结论 9 参考文献 . .11 - 3 - 引 言 1957 年 Isaacs Lindenmann 发现干扰素及其 作用， 20 世纪 80 年代，美国、瑞士等国的科学家以基因工程的方式，把干扰素制备成治疗药物，投放市场，它很快成为国际公认的治疗肝炎、肿瘤等疾病的首选药。 注射用重组人干扰素 2b 主要用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卡波氏肉瘤、卵巢癌、基底细胞癌、表面膀胱癌等。还可用于治疗某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿
3、疣。 - 4 - 第一章 注射用重组人干扰素 2b简介 第一 节 基因工程菌 E.coli DH 5/pUB 419 将含有人 2b 干扰素基因 cDNA 的 pBT 319 用 EcoR I 和 Pst I 酶消化，通过克隆，组建高效表达目的基因的质粒 pUB 419，将此质粒转化大肠杆菌 DH5 株，建成高效表达人 2b 干扰素的工程菌。 2b 干扰素 cDNA 插入片断的核苷酸序列，经测定与文献报导相符。 质粒 pUB 419 特点为： 一 、 Trp 启动子，以增强表达量； 二 、四环素抗性基因； 三 、质粒 -宿主稳定性好。 目的基因表达产物经免疫方法鉴定，它的活性不能被抗人 1 干
4、扰素，抗 干 扰素血清所中和，而能被抗人白细胞和类淋巴细胞所中和。产物分子量及氨基末端氨基酸序列与文献报导的人 2b 干扰素相同。 第二节 生产工艺 一 、工程菌发酵工艺 在摇瓶研究的基础上，使用 B.Braun 公司 10 升自动发酵罐进行了大量试验。对培养基的配方及补料方式逐项进行了深入的研究，建立了工程菌高密度、高表达发酵工艺。工程菌发酵周期 15-17 小时，发酵最终浓度为 100g 菌体湿重 /L左右，效价稳定在 8 10108IU/L。 二 、干扰素纯化工艺 具体纯化路线为： 高压匀浆破菌 酸碱变性处理 硫酸铵盐析级分 葡聚糖 凝胶脱盐 CM 纤维素离子交换层析 单克隆抗体免疫亲和
5、层析 分子筛凝胶过滤层析 。 菌体经匀浆缓冲液悬浮后，通过高压匀浆泵 2 次匀浆处理，可将绝大部分菌体彻底破碎，经高速离心分离得到的上清液用盐酸调至 pH2.5 左右，充分利用了 干扰素耐酸性的特点，使大量杂蛋白及核酸类物质变性沉淀。这样离心后得到的上清再经硫- 5 - 酸铵盐析级分，大大地浓缩了提取液，并有较好的纯化效果。然后，通过脱盐、上CM 纤维素柱层析，进一步去除了杂蛋白及核酸，为进行免疫亲和层析作好了准备。经过单抗亲和层析，产品纯度一般可达 90%。再经过分子筛层析，就能 顺利地得到纯度 95%以上的 2b 干扰素成品。 第三节 质量控制 质量控制参照中国生物制品规程 2000 年版
6、重组人干扰素 2b 制造及检定规程进行。 - 6 - 第 二章 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位） 稳定性实验 第一节 实验目的 考察注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）在实际保存条件（ 28 ）下，长期存放其外观（是指冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、生物活性、pH 值随时间变化的规律。 第二节 实验材料 一 、稳定性试验设备 ： 28 冰箱。 二 、生物活性测定 。 三 、 pH 值测定：酸度计，标准 pH 值溶液（ 4.00； 6.86； 9.18） 。 四 、成品外观色泽及澄明度测定：标准浊度液、伞棚灯 。 五 、无菌试验：百级层流、隔水式电热恒温培养
7、箱、硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基 。 第三节 实验方法 一 、 稳定性重点考察项目 成品的 外观（是指冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、生物学活性 、pH 值、温度。 其它检测项目：无菌试验。 二 、 长期试验 见中华人民共和国药典 2000 年版二部附录 XIX C“ 药物稳定性试 验指导原则 ” 。 供试品于 28 放置 12 个月，每 3 个月取样一次，分别于 0 个月、 3 个月、 6 个月、 9 个月、 12 个月，按稳定性重点考查项目进行检测， 12 个月后继续考查，分别于 18 个月、 24 个月、 36 个月取样进行检测，将结果与 0 月比较，对结果
8、进行统计分析。在试验结束时做无菌试验检测，将结果与 0 月比较。 - 7 - 三 、实验样品 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）连续三批生产样品： 表 1. 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位） 2ml西林瓶装 规 格IU/支 批 号 检测日期 0 1 3 6 9 12 18 500 万 20030301 03 年 3 月 15 日 03 年 4 月 13 日 03 年 6 月 17 日 03 年 9 月 15 日 03年 12 月18 日 04 年 3 月 15 日 04 年 9 月 15 日 20030302 20030303 （二） 对照样品：注射用重组人干扰素
9、 2b（ 300、 100 万国际单位）连续三批生产样品： 表 2. 注射用重组人干扰素 2b（ 300、 100 万国际单位） 2ml西林瓶装 规 格 IU/支 批 号 检测日期 0 1 3 6 9 12 18 24 36 300 万 20010204 01 年 2 月 15 日 01 年 3 月 17 日 01 年 5 月 16 日 01 年 8 月 15 日 01 年11 月 14 日 02 年 2 月 15 日 02 年 8 月 17 日 02 年 2 月 15 日 03 年2 月 17 日 20010205 20010206 100 万 20010201 20010202 20010
10、203 第四节 结果与分析 一 、测定结果 （ 一 ）注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）连续三批生产样品的稳定性：稳定性考察结果见表 3、表 5。以存放时间为 t，以相当于 0 月活动的百分数的对数为纵坐标，做 log（ C/C0）对 t 的散点图，并做趋势分析，见图 1。 （ 二 ）注射用重组人干扰素 2b（ 100、 300 万国际单位）（西林瓶装对照）三批- 8 - 样品的稳定性见表 4、表 6 及图 2、图 3。 二 、结果分析 （ 一 ）外观（色泽、澄明度）等变化 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）于 28 存放条件下，生产样品在18 个月后成品外观（是指
11、冻干粉的颜色和加水溶解后的色泽与澄明度）、 pH 值未发现明显变 化，无菌试验均合格。 （ 二 ）生物学活性变化 1、 注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）连续三批样品：经 28 存放 18个月后生物学活性相当于 0 月活性的 96.6%，仍符合质量标准，与初步稳定性实验 “9个月活性无较大变化 ” 的结果相符。根据表 7 和图 1 进行回归分析，结果表明注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）在 28 实际保存条件下，在 30.7 个月内其生物学活性仍能符合质量标准。与对照品（ 100、 300 万国际单位）稳定性长期实验结果比较， 100、 300 万和 500 万 I
12、U/支三个规格在 28 实际保存 条件下，存放 18 个月其活性仍相当于 0 月活性的 97%左右；保存 24 个月时 100、 300 万国际单位二个规格的活性仍在 98%左右。 2、 对照品（ 100、 300 万国际单位）：连续三批产品在 28 保存 31 个月后生物学活性相当于 0 月活性的 85%，符合质量标准； 36 个月后生物学活性相当于 0 月活性的 83%以上，根据图 2 和图 3 的分析结果表明： 100、 300 万 IU/支 2 个规格在 28实际保存条件下有效期在 30 个月以上。 三批 产品（ 100、 300 万 IU/支）经阴凉库留样及实际保存条件的稳定性考察，
13、产品有效期也在 30 个月以上 。见表 4、表 6。 第五节 结论 一 、注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）的在 28 实际保存条件下随时间变化的指标是：生物学活性。 二 、注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位） 18 个月内很稳定，与对照品注射用重组人干扰素 2b（ 100、 300 万国际单位）比较，稳定性基本相同。故初步认为注射用重组人干扰素 2b（ 500 万国际单位）的有效期在 30 个月以上。 - 9 - 第 三 章 结论 按中国药典 2000 年版 “ 药物稳定性试验指导原则 ” ， 100 万 IU、 300 万 IU/支三批成品在 28 保存 36 个
14、月， 500 万 IU/支观察 18 个月。 100 万 IU、 300 万 IU/支二个规格保存 24个月活性基本不下降； 36个月时其生物活性相当于 0月活性的 83%以上。规格为 500 万 IU/支在观察的 18 个月内其生物学活性基本不下降。根据长期实验数据进行回归分析，得出： 100 万 IU、 300 万 IU和 500 万 IU/支 3 个规格在 28分别存放 31.9、 42.5、 30.7 个月其生物学活性相当于 0 月活性的 85%。即其生物学活性保存 30 个月以上仍能相当于 0 月活性的 85%。仍能符合企业内控标准和国家标准（ 国家标准为该规格标示量的 80%150%，企业内控标准为 85%145%） 。 - 10 - 参考文献 国家药典委员会： 中国药典， 化学工业出版社， 2000 年版 。 国家药典委员会： 中华人民共和国药典， 化学工业出版社， 2000 年版 。 中国生物制品标准化委员会 ： 中国生物制品规程， 化学工业出版社， 2000 年版 。
