1、1第 1 章 基因工程概述第一节 基因操作与基因工程基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它 DNA 元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳
2、定遗传给下一代。 第二节 基因工程是生物科学发展的必然产物1、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是 DNA 也可以是 RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等） 。基因工程的理论基础：. 明确了遗传信息的携带者基因的载体是 DNA，明确了遗传的物质基础。. DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗
3、传信息的流向和表达问题。(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：. DNA 体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和 DNA 连接酶的发现与应用，标志着 DNA 重组时代的开始） 。 . 克隆载体的发展与应用。. 大肠杆菌转化体系的建立。. 琼脂糖电泳技术的应用。. DNA 测序技术的应用。. 核酸杂交技术的应用。 从技术上为基因工程的诞生奠定了基础。四、基因工程的内容1、基因操作原理：（1）DNA 和 RNA 的操作。（2）基因克隆与功能研究。（
4、3）基因组学与生物信息学的应用。2、基因工程的应用：（1）生物反应器（bioreactor ）：大规模生产生物活性分子如生长激素、胰岛素等。（2）遗传改良（genetic improvement） 、分子育种（molecular breeding） 、设计构建新物种。（3）基因治疗（gene therapy）：人体转基因或基因组编辑。第三节 基因的结构基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响1、基因及其产物的共线性：一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应。N 个氨基酸=3N 个编码碱基。2、基因及其产物的非共线性。间断基因。2内含子（intron）是指真核基因在 RNA
5、加工过程中从原初转录本中剪去而不进入成熟 RNA 结构、不具有氨基酸编码能力的一段序列。外显子（exon）：是真核基因转录本中剪去内含子后所保留的 RNA 片段，它们拼接并进行适当修饰后成为成熟 RNA 并执行相应功能。3、基因的重叠性与可变性：基因的重叠性：单个 DNA 序列可编码一个以上的蛋白质，它们在结构上可以具有序列重复性，也可以是相互完全不同的全新蛋白质。原因：可变性转录起始位点、可变性起始位密码子、可变性编码终止位点、可变性剪接。开放读码框（open reading frame，ORF ）：成熟 mRNA 中从起始密码子 ATG 至终止密码子（TAA 、TAG 或 TGA 之一）之
6、间形成的一个连续的氨基酸编码区间。以起始密码子的第 1 个碱基作为+1，其 5方向的第 1 个碱基为-1。4、启动子和终止子启动子（promoter）：基因转录过程中控制起始的部位，通常是位于转录起始位点 5上游的一段DNA 区间，其上有许多顺式元件。转录起始位点（transcription start site）：起始转录的第一个碱基，也是掺入到 RNA 中的第 1 个碱基。在转录研究中记为+1，其 5方向的第 1 个碱基（已属于启动子而非转录区）为-1。侧翼序列（flanking sequence）：一条核酸单链上位于某一特定位置的 5或 3方向的序列。上游（upstream）：一条核酸单
7、链上位于某一碱基的 5方向。下游（downstream）：一条核酸单链上位于某一碱基的 3方向。终止子（terminator）：位于基因的 3部位、终止基因转录过程的一段 DNA 区间。有依赖不依赖 因子两种。核糖体结合位点（ribosomal binding site, RBS）：位于 mRNA 起始密码子及其正上游的一段区间，是核糖体结合并起始翻译过程的位点。原核和真核的 RBS 显著不同。转录单位（transcription unit）/ 转录本（transcript ）：从转录起始位点直至转录的最后一个碱基之间被转录的 RNA 序列，可以包含一或多个蛋白编码框。亚克隆（subcloni
8、ng）：1、将大片段克隆子的 DNA 重新打断成小片段，然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究。初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆” 。2、通指将 DNA 片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。亚克隆技术：泛指实验室中以 DNA 在大肠杆菌中经典克隆操作为核心的基本技术体系。第 2 章 分子克隆工具酶第一节 限制性内切酶一、限制与修饰1、限制与修饰现象：限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶（restriction
9、 ednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。限制作用实际就是限制性内切酶降解外源 DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰(modification)：指寄主本身的 DNA，由于在合成后通过甲基化酶（ methylase）的作用得以甲基化，使 DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤 A 成为 N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为 5-甲基胞嘧啶。限制酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核
10、酸水解酶。 限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。33.限制性核酸内切酶的种类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三大类。型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，s 型识别序列和切割位置特殊。二、限制酶识别的序列1、限制酶识别序列的长度(n)：一般为 4-8 个碱基对，最常见为 6bp。识别位点出现频率：4n2、限制酶识别序列的结构：多数为回文结构（palindrome）即镜像对称结构。一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。3
11、、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。三、限制酶的功能和产生的末端类型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解 DNA 链中的磷酸二酯键，产生的 DNA 片段 5端为 P，3端为 OH，识别序列一般为 46 个碱基对，通常是反向重复顺序，具有 180的旋转对称性，即回文结构。限制性核酸内切酶切割双链 DNA 产生 3 种不同的末端类型。 1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为 5突出和 3突出的粘性末端（cohesive/sticky end）两种。2、平末端（blunt end）：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低
12、 100 倍左右。3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。4、同裂酶（isoschizomer）：不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。例：Sma(CCC GGG) 和 Xma(CCCGGG)5、同尾酶（isocaudarner）：不同限制酶识别序可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。例：Xho(CTCGAG) 与 Sal(GTCGAC)、BamHI(GGAT
13、CC)和 Bgl(AGATCT)6、归位内切酶（homing endonuclease）：一些线粒体、叶绿体、核 DNA 和 T 偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为 I-prefix）或内含肽（intein）具有内切酶活性（称为 PI-prefix） 。它们识别序列很长，核心识别序列一般为 10-12bp，识别位点极少。四、DNA 末端长度对限制酶切割效率的影响限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的 DNA，否则会降低切割效率。对侧翼长度敏感性较低的酶有 EcoR等，只要一个侧翼碱基即保证 90%的效率。 对侧翼长度敏感性高的酶有 Acc、Hind、Pst 等，侧翼
14、3 个碱基以上也未必理想。设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重要。限制酶的活性单位（unit）：1 个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在 20l 反应液中反应1h，使 1g DNA（多用 ）完全消化所需要的酶的量。五、位点偏爱某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱。某些噬菌体 DNA 中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。 噬菌体 DNA 为 48502bp，两端为 12bp 粘性末端。EcoR酶切割 噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分4子中间的位
15、点切割快 10 倍；EcoR对腺病毒 2DNA 不同位置切点的切割速率也不同。由于位点偏爱性， DNA 用 Hind消化而制备的 Hind DNA marker 中 4.3kb 条带甚至比2.0kb 条带还弱。原因：切割时需要同时与 2 个识别位点作用（如 Nar等） ，或识别和切割时要求在 DNA 上有 2 个明显不同的结合位点，其中 1 个是另 1 个的被切割时起激活作用的变构位点。应对办法：超量用酶、延长切割时间。七、限制酶的星活性(star activity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列不同但相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核
16、酸内切酶的星活性。产生原因：反应体系中甘油的浓度大于 5%。酶用量过大，大于 100 U/g DNA。低离子强度，小于 25 mmol/L。高 pH，大于 8.0。含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非 Mg2+的二价离子的存在。易发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、 SalI、HinfI 等。 办法：对因改进。八、单链 DNA 的切割多数限制酶很难切割单 DNA 模板。部分限制酶除切割双链 DNA 外，还可切割单 DNA，但活性一般都不高。切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要加一个 N。九、酶切位点的引入现
17、代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方便进向目标位置引入设计的酶切位点。通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位点，对具体情况的分析在设计中有价值：5突出末端补平后重连；同尾末端连接；平末端连接。十、影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA 样品的纯度DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl 等都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1g DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间DNA 样品的甲基化程度大肠杆菌中的 dam 甲基化酶在 5GATC3 序列中的腺嘌呤 N6 位引入甲基，受其影响的酶有BclI、Mbol 等，但 BamH
18、I、BglII、Sau3AI 不受影响。大肠杆菌中的 dcm 甲基化酶在 5CCAGG3 或 5CCTGG3序列中的胞嘧啶 C5 位上引入甲基，受其影响的酶有 EcoRII 等，但 BglI、KpnI 不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒 DNA，可防止 DNA 的甲基化。十一、基因组中酶切位点分布的不均一性在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。大肠杆菌中六碱基识别的酶 Spe平均 60kb 才出现 1 次。酵母中重复序列以外富含 GC 的识别序列较少。哺乳动物基因组中 CG 序列只有随机概率值的 1/5，且多数发生胞嘧啶甲基化，Sma 位平均约565kb 才出现 1 次。果蝇和线
19、虫中 CG 基序虽然少，但不发生甲基化。限制性核酸内切酶操作的注意事项商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的 10%，否则酶液中的甘油浓度超过 5%时将会抑制酶的活性。整个操作应在 0进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。当切割大量 DNA 时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。当 DNA 需 2 种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用 1 种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的 DNA。限制性核酸内切酶的主要用途在特异位点上切割 DNA，产生
20、特异的限制性酶片段。建立 DNA 分子的限制酶图谱。构建基因文库。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。改建质粒。第二节 甲基化酶一、甲基化酶的种类原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase） ，又称甲基转移酶（methyltransferase） ，大肠杆菌中有 3 种。三、甲基化对限制酶切的影响1、修饰酶切位点：敏感的酶不能切开。2、产生新的酶切位点：为依赖于甲基化的限制酶创造切点。3、对基因组作图的影响：哺乳动物具有较多的 m5CG 序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的 m5CG 甲基化不彻底，所以用 m5CG 甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响
21、。植物的基因组 DNA 的甲基化程度高，作图时也要求选用对 m5CG 甲基化不敏感的限制酶。第三节 DNA 聚合酶DNA 聚合酶（DNA polymerase）的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTPs 等情况下）及其相辅的活性。真核生物有 4 种 DNA 聚合酶：、线粒体型。原核生物有 3 种 DNA 聚合酶：、型。二、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段(Klenow fragment)（1）Klenow 酶的基本性质：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理,获得 N 端三分之二的大肽段,即 Klenow 酶。Klenow 酶仍拥有 53的 DNA 聚合酶活
22、性和 35的核酸外切酶活性，但失去了 5 3核酸外切酶活性。（2）Klenow 酶的基本用途（可被 T4 DNA 聚合酶代替）：补平由核酸内切酶产生的 3粘性凹陷末端抹平 DNA 的 3粘性凸出末端DNA 片段的同位素末端标记cDNA 第二链的合成双脱氧末端终止法测定 DNA 序列三、T4 DNA 聚合酶(T4 phage DNA polymerase)（1）T4 DNA 酶的基本特性：有 35的核酸外切酶活性和 53 的 DNA 聚合酶活性。6在无 dNTP 时，可以从任何 3-OH 端外切在只有一种 dNTP 时，外切至互补核苷酸。 在四种 dNTPs 均存在时，聚合活性占主导地位。四、T
23、7 噬菌体 DNA 聚合酶(T7 phage DNA polymerase)持续合成能力最强有 35 外切酶活性是 Klenow 酶的 1000。可代替 T7 噬菌体 DNA 聚合酶的用途。五、耐热性的 DNA 聚合酶（第八章详讲）来自噬高温细菌，如 Taq、Pfu 等。高温下具有 53 DNA 聚合酶活性，一般在 72最理想。有 53 外切酶活性。具 35 外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如 Pfu。否则无校正功能，如 Taq。用于 PCR 扩增。反转录酶：是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，以 RNA 为模板聚合 cDNA 链，具有 53的 DNA聚合酶活性、53的
24、RNA 外切核酸酶活性和 RNase H 活性，但缺乏 35RNA 外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。 末端转移酶：是不依赖于模板的 DNA 聚合酶，催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3羟基端。可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。第四节 其它分子克隆工具酶一、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 ATP（DNA dependent RNA polymerase）包括 SP6 噬菌体和 T4 噬菌体RNA 聚合酶。活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。用途：体外合成 RNA 分子作探针等。用于表达外源基因的 mRNA，然后
25、用于翻译蛋白。二、DNA 连接酶(DNA ligase)DNA 连接酶能催化双链 DNA 切口处的 5-磷酸根和 3 -羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的 DNA 连接酶以 NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以 ATP 作为能量来源。1、T4 DNA 连接酶的作用机制：ATP + DNA ligase (E) E-AMP + PPi 。E-AMP 上的 AMP 转移到 DNA 的 5磷酸根上，使其活化，释放出酶。活化的 5磷酸根与相邻的 3羟基形成 3,5-磷酸二酯键，并释放出 AMP。3、平头双链 DNA 片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性
26、核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10 倍大于粘性末端的连接） 。加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入 10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用。加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度 150-200 mmol/L。第 3 章 基因工程载体一、基本概念利用重组 DNA 技术分离目的基因，称之为基因克隆(gene cloning)。克隆(clone) ：作物动词时是指从单一祖先产生同一的 DNA 分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖
27、下来的一群遗传上同一的 DNA 分子、细胞或个体所组成的特殊群体。基因文库(gene library)：由大量的含有基因组 DNA 的不同 DNA 片段的克隆所构成的群体。7载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA 分子。2、分类按载体功能分：克隆载体、表达载体按载体性质分：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体表达体系 载体 宿主原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌酵母表达体系 大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒 酵母转基因植物体系 大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti 质粒） 、病毒等 植株哺乳细胞表达体系 大肠杆菌-病毒穿梭载体、脂质体等 培养动
28、物细胞基因直接导入 DNA 本身（基因枪微粒轰击法、注射法等） 生殖细胞、体细胞、个体三、基因工程载体必须具备的条件：（1）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化表示载体必须具备的条件第一节 质粒载体一、质粒(plasmid)的基本特性Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环 DNA 分子。质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链 DNA 分子。质粒 DNA 多呈超螺旋的共价闭合环状 DNA (covalently closed circular, cccDNA)，大小为
29、 1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。编码抗菌素抗性基因的质粒叫 R 质粒。质粒 DNA 在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为 1-5 个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达 10-200 个拷贝） 。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型
30、决定的，如 pMB1 或 ColE1。pUC 系列载体中的突变型 pMB1 复制子可达 500-700 个拷贝。3、质粒的不亲和性(incompatibility) ：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。质粒载体应具备的条件：1 有特定的复制起始子。2 有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有 1 个；2 有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；3 有一定容量；4 有相当的拷贝数， 即每个宿主菌可能容
31、纳的最多数。二、标记基因81、转化子标记基因：用于鉴别目的 DNA 的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解 - 内酰胺环。Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶。Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性 tRNA，可翻译 UAG 为酪氨酸。赭石突变（UAA ） ，乳白突变（UGA） 。正向选择标记：蔗糖致死基因 sacB。2、重组子标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。-互补 ( complementation)：人工突变使大肠杆菌的 -半乳
32、糖苷酶基因(lacZ) 缺失 N-端的第11-41 位氨基酸，而载体则携带有 LacZ 基因的 N-端 140 个氨基酸和编码区段(lacZ) ，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的 LacZ 酶。多克隆位点(multiple cloning site，MCS)：载体上的一段人工设计和人工合成的 DNA 序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。插入失活(insretional inactivation)：当一段足够长的外源 DNA 片段插入到一个功能基因的编码区后，导致 ORF 移码或提前终止，严重破坏原基因的
33、编码能力而使该基因失活。蓝白斑筛选(white-blue screening)：空载体转化子经 IPTG 诱导表达后，由于 - 互补而形成的功能性的 LacZ 蛋白，能够转化无色底物 X-gal 而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于 lacZ基因的插入失活而不能形成 - 互补，在 IPTG+X-gal 条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑) ；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。三、质粒载体的种类质粒的发展阶段第一阶段（1977 年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101、ColE1、pCR、pBR313 和pBR32
34、2。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度） ，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如 pUC 系 列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp 系列载体，含T3、T7、SP6 启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。许多实用的质粒载体都是在 pBR322 的基础上改建而成含 LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13 的多聚接头 polylinker。pUC18 与 pUC19 只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致。表达载体：一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等。如 Novagen 的
35、 pET 系列、Qiagen 的 pQE 系列。第 2 节 噬菌体载体一、 噬菌体的分子生物学 噬菌体的组成结构和用途噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫” 。它本身是一种核蛋白，核心是一段 DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的 DNA 注入细菌内。 噬菌体为线性双链 DNA 的细菌病毒，具有互补的 12bp 粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长 48531bp，含 50 多个基因。 噬菌体基因大致分为 4 个区：结构区：AJ 19 个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区。组区 att(attac
36、hment)、int(intagrate) 及xis(excission)。调控区启动子、终止子和 N、CI 基因。裂解区： Q-R。 噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达 20kb 的 DNA，换入相应长度的目9的基因。基因文库构建常使用 载体。不少先进的质粒应用 组件进行构建。四、 载体的克隆原理和步骤1、通过裂解过程增殖 载体。2、载体与外源 DNA 的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。3、外源 DNA 与载体的连接，形成的是多联体。4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对 DNA 大小有选择性。5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过
37、 的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个 的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque) 。6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组 ，所有噬菌斑的集合就为一个文库。pfu: plaque forming unit，噬菌斑形成单位，指每微克包装 DNA 感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求 100 万以上。第四章 人工染色体载体第一节 粘粒载体一、粘粒的结构特征和用途粘粒实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。cos 序列是 l 噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。粘粒的组成包括质粒复制起点、抗性标记、cos
38、 位点，因而能像质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。二、粘粒载体的工作原理粘粒载体的主要工作原理类似 l 噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于 l 噬菌体载体的左右臂， cos 位点通过粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联体。当多联体与 l 噬菌体包装的蛋白质混合时 l 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割成两个 cos 位点，并将两个同方 cos 位点之间的片段包装到 l 噬菌体颗粒中去。允许插入片段为 30-45kb。三、粘粒克隆
39、载体粘粒 pJB8、含双 cos 位点的粘粒载体、pcos1 EMBL 等。四、粘粒载体文库的扩增和贮存噬菌体颗粒状的粘粒文库在含有几滴氯仿的 SM 溶液中可以保存几周。可以采用影印到硝酸纤维素膜上保存、挑取所有菌落混合培养后深冷保存，等。第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome，YAC）：就是模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体。一、YAC 载体的复制元件YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细
40、胞间的分离及保持染色体稳定的需要。端粒重复序列：是定位于染色体末端的一段序列，用于保护线状 DNA 不被胞内的核酸酶降解，已形成稳定的结构。着丝粒：是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。二、YAC 载体的工作原理10YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图示是 pYAC4 载体的遗传结构图，当用 BamH切割成现状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要順式元件。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定
41、着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。允许插入片段大小：没有限制，一般为 250-1500kb。YAC 的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，YAC 与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。YAC 的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合作真核染色体片段功能研究。第三节 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。F 质粒：是一个约 100kb 的质粒，编码 60 多种参与复制、分配和结合过程的
42、蛋白质。1、BAC 载体及其结构组成BAC 载体大小约 7.5kb，其本质是一个质粒克隆载体。BAC 载体与常见克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性。复制单元来自 F 质粒二、BAC 载体工作原理BAC 载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。不同的是，BAC 载体装载的是大片段 DNA，一般在 100300kb。对如此大的 DNA 片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另外，由于 BAC 载体的拷贝数小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将 BAC 载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。第四节 P1 噬菌体
43、载体和 P1 人工染色体载体一、P1 噬菌体的分子特征：双链线状 DNA，110kb，末端具有 10kb 左右冗余序列，感染进入大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环状分子，c决定进入溶原或裂解状态。包装方式与 不同。二、P1 噬菌体载体元件：复制元件、环化和包装信号、标记基因、克隆位点、填充片段。P1 噬菌体载体工作原理：与粘粒相似。三、P1 人工染色体载体：结合了 P1 噬菌体载体和 BAC 载体的最佳特性，如 pCYPAC1，允许外源片段为 130-150kb，采用电转化，外源片段的嵌合和重组现象较低，对重组序列的回文结构的忍受性强。第五章 表达载体第一节 大肠杆菌表达载体一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。1、表达元件(expression elements)：1）启动子(promoter)：三类，即lac 启动子、trp 启动子和它们的杂合启动子 tac 或 trc，都受 IPTG 诱导。T7 噬菌体启动子 噬菌体的 PL 启动子。2）终止子：依赖于 因子或不依赖于 因子（遇茎环结构而终止） 。3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG 与 RBS 之间的距离很重要，一般 3-11bp。
