1、甲型 H1N1 流感病毒实验室检测技术方案(试行)本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型 H1N1 流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活 动或赢利目的。一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于 4 （冰箱），并马上送至实验室。 （临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。 ） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1 感染病例标本采样单。 （附表 1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯
2、纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含 3 毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在 4（不能超 过 4 天）或者 -70或-70以下。有条件的实验室均应保存在-70 或-70以下。不 应保存在-20。4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复 冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。5、标本的运输疑似人感染甲型 H1N1 感染病例列为 A 类，用 UN2814 包装运输。填写疑似人感染甲型 H1N1 感染病例标本送检单（附表 2）。二、核酸检测基于 PCR 原理
3、的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。1、基于 real-time RT-PCR 的方法检测新的甲型 H1N1 流感病毒（引物和探针序列为美国 CDC 设计）： 4 月 29 日 WHO 网站上公布了美国 CDC 设计的针对此次甲型 H1N1 流感病毒的 real-time RT-PCR 引物和探针，此 实验用于 检测疑似甲型 H1N1 流感病例的呼吸道样本, 因此，用此 real-time RT-PCR 的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和 H5N1 禽流感病毒。real-time RT-PCR 方法参见附件3（中文翻译版），附件 4
4、（英文原版）。2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：目前国家流感中心设计了 RT-PCR 方法检测新的甲型 H1N1 流感病毒。RT-PCR 的方法参见附件 5。 三、病毒分离鉴定可采用鸡胚和/或 MDCK 细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后 24h 内进行病毒接种。具体方法参见附件 6 和 7。四、适用于实验室工作人员的甲型 H1N1 流感病毒生物安全（一）实验室级别及个人防护1、对采集自属于感染甲型 H1N1 流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在 BSL-2 实验室内进行。所有 样本操作均应在生物安
5、全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。 2、对采集自属于感染甲型 H1N1 流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在 BSL-3 实验室内进行，并遵循生物安全三 级个人防护。（二）健康监测1、所有人员均应自测发热及其他症状。 2、感染甲型 H1N1 流感病毒的症状包括咳嗽、喉 咙 痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。 3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型 H1N1 流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的 7 天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。五、附表和附件附表 1 疑似人感染甲型 H1N1 感染病例标本采样
6、单附表 2 疑似人感染甲型 H1N1 感染病例标本送检单附件 3： real-time RT-PCR 方法检测甲型 H1N1 流感操作规程(2009 版)（中文）附件 4： real-time RT-PCR 方法检测甲型 H1N1 流感操作规程(2009 版)（英文） 附件 5： RT-PCR 方法检测甲型流感病毒附件 6：甲型 H1N1 流感病毒鸡胚分离方法附件 7：甲型 H1N1 流感病毒 MDCK 细胞分离方法附表 1疑似人感染甲型 H1N1 流感病毒病例标本采样单姓名 性别 年龄 职业 现住址 发病日期 标本#种类 标本量（g 或 ml） 采集日期 备注选项：参照传染病报告卡。#选项：
7、A 鼻咽拭子、 B 鼻咽吸取物、C 鼻腔冲洗液、D 鼻腔吸取物、E 气管吸取物、 F 其他（如为其他，请在表格中注明）采集人员： 采集单位（盖章）： 附表 2 疑似人感染甲型 H1N1 流感病毒病例标本送检单姓名 性别 年龄 职业 现住址 发病日期 标本#种类 标本量*（g 或 ml） 采集日期 备注选项：参照传染病报告卡#选项：A 鼻咽拭子、 B 鼻咽吸取物、C 鼻腔冲洗液、D 鼻腔吸取物、E 气管吸取物、 F 其他（如为其他，请在表格中注明）*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。填表人员： 送样时间： 单位（盖章）： 附件 3real-time RT-PCR 方法检测甲型 H1N1 流
8、感操作规程中文翻译版（请同时参考英文原版）请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。美国CDC 实时 RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009 版)本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。一、概 述（一）前提 本规程基于对rRT-PCR 方法的基本掌握。（二）实验原理实时荧光定量RTPCR(rRTPCR) 法检测猪流感的方案是用一 组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan 探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。 InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swIn
9、fA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1 引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于 检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。（三）使用条件一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。（四）生物安全要求样本处理应在相应的生物安全实验室完成。（五）样本要求1、呼吸道样本支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采 样不可取。2、排除标准1）未在24C (4 天) 或-70C及以下保存的样本2）以上未列的其它不当样本（六）核酸提取 RT-
10、PCR扩增效能依赖于样本模板RNA 的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于 样本实验。商 业化的操作程序中包括 QIAamp 病毒RNA 提取试剂盒，RNeasy 小试剂盒 (QIAGEN公司)， 罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离 试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯 度的RNA。（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。二、实验材料（一）试剂1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；3、正反向引
11、物 (40M)；4、双重标记探针(10M)；5、阳性对照。（二）供给1、实验室标记笔；2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；3、20l 和 200l 可调节移液器及滤芯枪头；4、0.2ml PCR 反应管盘；5、光学反应盖板；6、无菌,无核酸酶的1.5 ml 微量离心管；7、一次性无粉手套。（三）仪器设备1. 微量离心机；2. 漩涡振荡器；3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。三、操作程序（一）准备工作1. 避免样品污染由于fluorogenic 5核酸酶测定的敏感性， 应特别注意假阳性 产生。推荐以下预防污染的方法：1）实验准备与核酸提取使用独立区域；2）实
12、验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。2、仪器准备工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY ”来减小核酸交叉污染的风险。3、试剂准备注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。1）引物和探针（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻 融）；（2）涡旋振荡引物和探针；（3）瞬时离心
13、引物和探针，之后置于冰架上。2）Real time RT-PCR的试剂（1）将Master Mix和酶置于冰架上；（2）融化2 的 Reaction Mix；（3）颠倒混合2的Reaction Mix；（4）瞬时离心2的Reaction Mix和酶，置于冰架上。4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探 针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC ）。3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。5、建立反应反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对
