1、大肠杆菌 抗 氧化应激 反应 的蛋白质组学分析 摘 要 在 细胞代谢过程中，部分电子逃逸出氧化还原系统 ， 以氧分子作为电子受体，产生具有毒害作用的高能量活性氧分子 （ reactive oxygen species， ROS） ， 包括超氧阴离子、单线态氧、 过氧化氢 、羟自由基 和 脂质过氧化的中间产物。 活性氧是一种广谱杀菌剂，是宿主 细胞 抗菌作用的有效方式。但细菌在长期的进化 过程中必然会 发展出多种对策来抵抗宿主 所 产生的活性氧的 杀菌作用 。 为检测与此相关的蛋白质，本研究主要通过正常及氧化应激条件下对大肠杆菌 k12的培养，差速离心法提取膜 蛋白 进行SDS-PAGE， 挖取
2、 具有明显差异的蛋白质条带 ，经胶内酶切 处理 ，利用 基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱 (MALDI-TOF-MS/MS)进行 鉴定分析。 结果 鉴定到 两 种具有明显差异的蛋白 ， 麦芽糖孔蛋 白 、外膜蛋白 OmpA表达量明显下降， 这两种蛋白 主要与小分子物质渗透进入细胞有关， 因此可以推测细菌为了适应周围环境的改变 关闭膜 上小分子通道 ，减少过 氧化 氢摄入细胞内， 进而减少过氧化氢的毒害作用 。 通过本研究，我们可以初步阐明大肠杆菌的氧化应激机制。 关键词 ： 活性氧 ； 氧化应激反应 ； 膜蛋白 ； MALDI-TOF MS/MS； 过氧化氢 ABSTRACT During
3、 the metabolism in the cell, oxygen molecules as an important electron acceptor, Also accompanied by some electronic escape from the redox system, produce some high energy reactive oxygen species which has poisoned, including superoxide anion (O2-), singlet oxygen, hydrogen peroxide, hydroxyl radica
4、l, also includes the intermediate products of lipid metabolism. Reactive oxygen species (ROS) is a broad-spectrum fungicide. It is one of the effective way to host cell antimicrobial. However, bacteria in the long-term evolution development of a variety of strategies to resist the host immune bacter
5、icidal action. To detect which proteins associated with this system, in this study, mainly through training two group of the pathogenic E. coli, the one Treatment by hydrogen peroxide, the other one as the control group, Broken cells by ultrasound. Extraction the membrane proteins by differential ce
6、ntrifugation, make a SDS-PAGE electrophoresis with the Protein, Digging the significant difference protein band, after gel digestion, then identified by MALDI-TOF-MS/MS. We found two proteins which have significant difference, they are Maltoporin and outer membrane protein A (OmpA). Maltoporin and O
7、mpA are associate to the small molecules penetrate into the cells. Therefore, we can speculate that to adapt to the environment Bacteria Close membrane channels of small molecules to reduce the intake of intracellular hydrogen peroxide, thereby reducing the toxicity of hydrogen peroxide. Through thi
8、s experiment, we can initially clarify the oxidative stress mechanism of E. coli. Keywords: Reactive oxygen species; Oxidative stress; hydrogen peroxide; Membrane protein; MALDI-TOF-MS/MS 目 录 摘要 ABSTRACT 第 1章 细菌抗氧化应激 反应的研究进展 . 1 1.1 蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用 . 1 1.1.1 金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析 . 1 1.1.2 幽门螺旋杆菌的蛋白
9、质组学分析 . 1 1.1.3 枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析 . 2 1.1.4 在其他菌株上的蛋白质组学分析 . 2 1.2 蛋白质组学分析的概括 . 3 第 2章 材料和方法 . 5 2.1 实验流程图 . 5 2.2 材料及主要实验仪器 . 6 2.3 试剂 . 7 2.4 实验过程 . 10 2.4.1 大肠杆菌扩大培养 . 10 2.4.2 氧化应激处理 . 10 2.4.3 细胞破碎 . 11 2.4.4 膜蛋白提取 . 11 2.4.5 制胶 . 11 2.4.6 样品处理 . 12 2.4.7 SDS-PAGE分析 . 12 2.4.8 MALDI-TOF-MS/MS 质谱鉴定
10、 . 13 第 3章 实验结果 . 14 第 4章 讨论 . 18 4.1 过氧化氢的浓度 . 18 4.2 质谱结果分析 . 18 4.3 前景展望 . 19 参考文献 . 20 致谢 . 231 第 1 章 细菌抗氧化应激反应的研究进展 1.1 蛋白质组学分析 在细菌抗氧化应激研究中 的应用 1.1.1 金黄色葡萄球菌的 蛋白质组学分析 中性白细胞通过活性氧 物质杀伤细菌，借助蛋白质组学方法可以发现不同菌株在氧化应激中蛋白表达差异，以研究其抗氧化机制。 Danchenko等 1用 LC-MS/MS技术对分别经 H2O2处理后的 RN6390和 UAMS1两种金葡菌菌株蛋白质特征进行分析，发
11、现了157种 UAMS1菌株特有的蛋白，其中 78种是未知的；有 131种 RN6390菌株特有的蛋白，其中 17种是未知蛋白。这些差异蛋白将有助于对涉及去氧化毒性和毒力的相关机制进一步研究。 Weber等 2利用高分辨率的 2-DE与 MALDI技术分析了金葡菌 COL菌株对氧化应激的特点。在指数生 长期加入 H2O2后，细菌出现生长停滞，甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (Gap)、还原酶 (AhpC)和酶 (MvaS)的等电点明显改变。由于氧化应激的条件下 ATP水平和 Gap活性密切相关，因此 H2O2引起的 Gap活性失活可能是其生长停滞的原因之一。相反， Throup等 3用 2-DE研究
12、了缺氧时 srhSR基因突变株蛋白表达特征，发现 srhSR剔除后导致了涉及到能量代谢和其他代谢过程如精氨酸分解、黄嘌呤分解以及细胞形态学的蛋白改变，提示葡萄球菌 srhSR体系在应答氧获得性发生改变时能量转移的调节起重要作用。 1.1.2 幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析 游运辉 4等利用固相 pH 梯度双向凝胶电泳分离胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌菌株的总蛋白质，凝胶经蓝银显色后，采用 PDQuest 图像分析软件比较、分析、识别差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱，然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。鉴定出 14 个差异蛋白质，包括抗氧化作用、分子伴侣、解毒
13、和 DNA 修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质。 2 1.1.3 枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析 Mostertz等 5对枯草 芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)在过氧化物刺激及超氧化物刺激下的应激反应进行了转录组学和蛋白质组学研究，结果发现氧化压力下的反应蛋白可以分为 2类：一类是在 2种氧化压力下具有相似表达模式的蛋白，如 PerR和 Fur调控元中的成员；另一类是仅对其中一种刺激敏感的反应蛋白，如 SOS调控元中的成员在过氧化物刺激下会表达上调，而参与硫酸盐同化过程及甲硫氨酸生物合成的蛋白仅在超氧化物刺激下诱导表达。在嗜热脂肪芽孢杆菌氧
14、化应激的蛋白质组学研究中，氧化压力能够诱导过氧化物酶的表达发生变化 6。此酶在凝胶上的位 置不同， 表现为 4种异构体形式 (Prx I、 Prx 1I、 PrxIII、 PrxIV )，它们都具有相同的相对分子质量 (27000)，却具有不同的等电点 (分别是 5 0、 4 87、 4.8l和 4.79)。 H2O2能诱导 Prx 、 PrxIII、 PrxIV蛋白的丰度增加，却使 Prx I的丰度减少。另外，延长氧化压力的作用时间不能改变这些异构体的表达水平。因此，这种异构体丰度之间的转化，可能是一种翻译后修饰现象造成的。此外，变异链球菌在氧化压力下，也有 69个蛋白的表达量升高，其中 l
15、5个是特异性感受氧化压力的应激蛋白；另 外还有 24个蛋白的表达量降低 7。 1.1.4 在其他菌株上 的蛋白质组学分析 Okano8等对革兰阴性菌 牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis)进行了有氧压力下的蛋白质组学分析。虽然牙龈卟啉单胞菌是一种厌氧病原菌， 但仍具有一定的氧耐受能力，因此能够引起慢性牙周炎。为了研究这种耐氧机制， Okano等对比了该菌在有氧压力条件下和厌氧条件下培养的蛋白表达谱。结果发现，在有氧压力情况下很多蛋白的表达受到了影响，特别是 HtpG、 GroEL、 DnaK、 AhpC、含有 TPR结构 域的蛋白，以及引发因子的表达量都持续升高。
16、从这些研究可以看出，厌氧菌与需氧菌的氧化应激研究策略也不相同：对于厌氧培养的细菌，有氧培养的条件就可以激发氧化应激反应；而对于有氧培养的细菌，则需要使用过氧化物来创造氧化压力条件。 3 1.2 蛋白质组学分析的概括 蛋白质组学 (proteomics)是在基因组学、蛋白质分离和质谱等技术相结合的基础上发展起来的，从整体的角度研究某一种细胞、组织或生物体蛋白质组成及其动态变化规律，了解蛋白质之间的相互作用与联系，获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整 体而全面的认识的一门新型学科。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。
17、蛋白质组学是对基因组学研究的重要补充和延伸。传统的单个蛋白质研究方式已无法满足后基因组时代的要求。要对生命的复杂活动有全面深入的认识，必然要在整体、动态、网络水平上对蛋白质进行大规模研究。蛋白质组具有动态的特点，蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与环境分子的关系。不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 蛋白质组学的技术平台主要包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学技术。在蛋白质分离方面，双向凝胶电泳 (2-DE) 9是最常用最经典的技术，此外还有高效液相色谱 (HPLC)、毛细管电泳 (CE)和毛细管色谱等非凝
18、胶的蛋白质分离技术。在蛋白质鉴定方面，生物质谱 (Bio-MS)是蛋白质组学研究所采用的核心技术。从质谱仪所采用的离子源来讲，生物质谱主要指以电喷雾电离 (ESI) 10和基质辅助激光解吸电离 (MALDI)为代表的两种 “软电离 ”质谱技术，称为电喷雾电离质谱 (ESI-MS)和基质辅助激光解吸 电离质谱 (MALDI-MS)，都具有高灵敏度和宽质量检测范围的特点。从质谱仪的质量分析器来讲，生物质谱常采用三级四极杆 (TQ)、三级四极杆 -飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间 (TOF/TOF)、离子阱 (IT)和傅里叶回旋共振 (FTICR)等质量分析器。采用不同的离子源和质量分析器组合，
19、就可构成性能各异的质谱仪。此外，有关蛋白质相互作用的研究技术也属于广义的蛋白质鉴定技术，如酵母双杂交、免疫共沉淀、生物传感器技术 (BIA-core)、荧光共振能量转移 (FRET)、蛋白质芯片 (ProteinChip)和基于免 疫荧光、荧光蛋白融合和激光共聚焦的细胞共定位技术等。由于生物信息学能将生物学实验数字信号转换成具有生物学意义的实验结果，在蛋白质组学研究中具有十分重要的意义： 采用图像获取、识别、定量及其差异对比等技术获取生物实验信息； 通过肽质量指纹图谱结合数据库搜索识别蛋白质； 用串联质谱数据搜索4 数据库识别蛋白质； 从串联质谱数据直接推测肽序列。 在实际应用中，各种蛋白质组
20、学研究技术可灵活组合、整合联用。最常见的策略是将上游的液相蛋白质分离技术与 ESI-MS 11在线联用 (如 CE-MS或 LC-MS联用 )，整合成 高通量自动化的蛋白质分离鉴定系统。还可将 MALDI-TOF-MS和 ProteinChip12结合，形成所谓表面增强激光解吸离子化 (surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI)技术 (Merchant和 Weinberger 2000)，这种新的方法是将待测蛋白质混合物和具有不同特性的芯片结合，洗去非特异性结合的蛋白后，再用 MALDI-TOF-MS鉴定特异性结合的蛋白质，就可获得基
21、于不同相互作用的多维蛋白质图谱。值得注意的是。ESI-MS13对样品 的前期处理要求较高，能与 HPLC等高通量分离技术在线联用，有利于提高效率。 MALDI-MS对样品的前期处理要求较低、适于混合样品鉴定，但只能与上游分离技术实现固相联用，不利于效率提高。此外，蛋白质组学还引入了定量分析14和差异表达 15的研究方法：基于质谱分析技术的化学标记定量法 16，如同位素编码亲和标签 (isotope-coded affinity tag， ICAT)技术 17 (Gygi等， 1999)。基于荧光染料的定量分析法，如二维差示凝胶电泳 (2-D DIGE)技术 (Lil-ley等， 2004)。蛋
22、白质组学研究的基本技术路线如细胞或组织样品、样品制备、 2DE分离蛋白 18。 随着蛋白质组学研究技术的不断成熟，蛋白质组学在研究疾病发病机制 19、药物作用原理等方面都得到了广泛的应用。细菌和真菌蛋白质组领域的研究正进人快速发展阶段。5 第 2章 材料和方法 2.1 实验 流程图 通过正常及氧化应激条件 20下对肠致病性大肠杆菌的培养， 差速 离心 21提取膜蛋白，对已提取的蛋白质做 SDS 电泳 22， MALDI-TOF-MS/MS 对差异蛋白进行鉴定分析。通过差异蛋白的功能分析阐明细菌对氧化应 激应答的作用机制。通过对正常及氧化应激条件下的差异蛋白质组分析，找到相关蛋白，通过对其功能分
23、析来阐明细菌的应答作用机制。 离心后 Tris-HCl重悬 超声破碎细胞使蛋白充分溶解 差速离心提取膜蛋白 差异蛋白做质谱分析鉴定 SDS-PAGE 电泳发现蛋白差异 扩大培养大肠杆菌 加入一定量的过氧化氢孵育 PBS 孵育 1 小时 6 2.2 材料及主要仪器 大肠杆菌菌株 K12 由浙江理工大学浙江理工大学蛋白质组学与分子酶学研究所保存；琼脂糖，电泳级 SDS、购自 Boehringer Mannheim公司。蛋白胨（ tryptone）、酵母提取物（ Yeast Extract）为英国 Oxoid 公司产品。 NaCl购自上海试四赫维化工有限公司，十二烷基硫酸钠（ SDS）、甲叉双丙烯酰
24、胺购自上海双向西巴斯科技发展有限公司，丙烯酰胺购自 BIO-RAD 公司，甘氨酸（ Glycine）、 TRIS Base 购自 KH公司，其余试剂为国产分析纯。 主要仪器如下： 超净工作台 上海博讯实业有限公司 紫外 /可见分光光度计 DU800 BECKMAN 公司 pH 计 Delta320 METTLER 公司 台式离心机 Eppendorf 公司 高速冷冻离心机 BECKMAN 公司 超低温冰箱 Thermo 公司 恒温培养摇床 上海智城分析仪器制造有限 公司 高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂 恒温培养箱 Thermo 公司 超纯水仪 ELGA 公司 电子称 ALC-110.4 上海精密科学仪器有限公司 DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 XB70 制冰机 Grant 公司
