1、 HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 硕士学位论文 MASTERS DEGREE DISSERTATION 吡喹酮透皮给药对日本血吸虫病虫卵肉芽肿的影响 EFFECT OF PRAZIQUANTEL TRANSDERMAL ADMINISTRATION ON SCHISTOSOMA JAPONICUM EGG GRANULOM 研 究 生 : 王熠 CANDIDATE： WANG YI 导 师 : 郑新生 教授 SUPERVISOR： PROFESSOR ZHENG XINSHENG 专 业 : 农药学 MAJOR： PESTICIDE SCIENCE 研究方向
2、: FIELD： 药物剂型 DOSAGE FORMS 中国 武汉 WUHAN， CHINA 二 一二 年六月 JUNE， 2012 分类号 密级 内部 华中农业大学硕士学位论文 吡喹酮透皮给药对日本血吸虫病虫卵肉芽肿的影响 Effect of praziquantel transdermal administration on schistosoma japonicum egg granuloma 研 究 生 : 王熠 指导教师 : 郑新生 教授 专业：农药学 研究方向：药物剂型 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间： 2012年 6月 华中农业大学理学院 二 一二年六月吡喹酮透皮给药对日本血
3、吸虫病虫卵肉芽肿的影响 i 目 录 摘 要 . 1 Abstract . 2 缩略语表 . 4 1 前言 . 5 1.1 日本血吸虫病及防治现状 . 5 1.1.1 血吸虫概述 . 5 1.1.2 血吸虫病发病机制 . 6 1.1.3 日本血吸虫病虫卵肉芽肿形成过程 . 7 1.1.4 血吸虫病临床类型 . 7 1.1.5 我国血吸虫病疫情现状 . 8 1.1.6 血吸虫病治疗概况 . 9 1.2 透皮给药概述 . 11 1.2.1 透皮给药发展 概况 . 11 1.2.2 透皮给药的特点 . 12 1.2.3 透皮给药的过程 . 12 1.2.4 透皮吸收的影响因素 . 15 1.2.5 透
4、皮给药系统研究进展 . 16 1.3 吡喹酮治疗血吸虫病概述 . 17 1.3.1 吡喹酮概述 . 17 1.3.2 吡喹酮的体内代谢 . 17 1.3.3 吡喹酮的毒性与副作用 . 18 1.3.4 吡喹酮杀虫作用与杀虫机制 . 19 1.3.5 吡喹酮对虫卵肉芽肿的作用 . 20 1.3.6 吡喹酮透皮给药的研究进展 . 21 1.4 选题的目的与意义 . 21 2 材料与实验方法 . 23 2.1 实验材料 . 23 2.1.1 主要试剂 . 23 2.1.2 实验材料 . 23 2.1.3 主要实验仪器 . 23 2.2 PZQ 混合组分溶媒的筛选及透皮性能预测 . 23 华中农业大学
5、 2012 届硕士研究生学位论文 ii 2.2.1 PZQ 在混合溶剂中溶解度的测定 . 24 2.2.2 PZQ 在水 -油两相溶液间分配系数的测定 . 24 2.3 PZQ 透皮剂对肝脏的毒性试验 . 26 2.3.1 PZQ 药剂的配制及给药过程 . 26 2.3.2 肝脏毒性试验动物模型的建立 . 26 2.3.3 肝脏病理切片的制作及病理检查 . 27 2.4 日本血吸虫卵肉芽肿的治疗实验 . 27 2.4.1 血吸虫感染动物模型的建立及给药 . 27 2.4.2 肝脏病理切片的制作及病理检查 . 28 3 结果与讨论 . 29 3.1 PZQ 的溶解度测定及其在临床应用意义 . 2
6、9 3.1.1 混合溶媒的稳定性 . 29 3.1.2 PZQ 在混合溶媒中的溶解度 . 29 3.1.3 PZQ 多组分透皮剂在临床应用的意义 . 32 3.2 PZQ 的油水分配系数及其透皮性能预测 . 33 3.2.1 PZQ 在油 /水两相溶液间分配系数的测定 . 33 3.2.2 PZQ 多组分透皮剂的透皮性能预测 . 34 3.3 PZQ 透皮剂的吸收及皮肤刺激性观察 . 34 3.4 PZQ 对肝脏的毒理实验 . 35 3.5 PZQ 对日本血吸虫卵肉芽肿的作用 . 37 3.5.1 PZQ 治疗对日本血吸虫卵肉芽肿的数目的影响 . 37 3.5.2 PZQ 透皮治疗对日本血吸虫
7、虫卵肉芽肿结构的影响 . 38 3.5.3 PZQ 治疗对日本血吸虫虫卵肉芽肿体积的影响 . 41 3.5.4 PZQ 透皮给药对肉芽肿的作用 . 42 3.6 肉芽肿消退机制的探讨 . 44 4. 结论 . 46 参考文献 . 47 致 谢 . 52 附录 . 53 吡喹酮透皮给药对日本血吸虫病虫卵肉芽肿的影响 1 摘 要 血吸虫病危害严重，传播范围广泛，对全球人类健康和畜牧业发展带来严重威胁。血吸虫病之所以危害严重，是由于血吸虫卵在动物的肝、肠等器官 引发肉芽肿，肝内肉芽肿最终发展为肝纤维化、肝硬化，引起宿主死亡。故肉芽肿是血吸虫病治疗的核心之一。 针对血吸虫卵肉芽肿的特殊病理结构，我们设
8、计了一种能够使抗血吸虫病首选药物吡喹酮透过皮肤、跨越肉芽肿递送屏障的透皮给药系统 。在制备了浓度为300mg/ml的吡喹酮透皮剂，确定它在体内能够维持较高的血药浓度并持续较长时间的基础上，首先通过药物的毒性试验以确定合适的经皮给药剂量，然后对血吸虫病动物模型实施透皮给药治疗并探讨吡喹酮经皮给药对肉芽肿的作用。 毒性试验确定了实验家兔合理的给药剂量，并发现同等剂量的吡喹酮给 药，口服给药途径比透皮给药对肝脏的毒性大。血吸虫病治疗试验发现，吡喹酮透皮给药能够使实验动物肝脏上虫卵肉芽肿数目、体积减少率分别达到 80%、 50%以上。通过透皮治疗组、灌胃治疗组和空白组的肉芽肿数据的对比分析，可以确定吡
9、喹酮不仅能杀灭血吸虫成虫，而且具有抗肉芽肿的作用。 此外，本课题从乙二醇苯醚（ EGPE）、四氢呋喃（ THF）、油酸（ OA）、二甲亚砜（ DMSO）和 1,4-二氧六环五种溶液的理化性质、配比、溶解度、油水分配系数入手，旨在开发多组分的混合透皮剂，使它们对药物的渗透产生协同作用，使吡喹酮的透皮效果 更佳。试验结果发现，二甲亚砜 -1,4-二氧六环和二甲亚砜 -四氢呋喃体系具有进一步研究的价值。 吡喹酮透皮给药系统克服了口服给药的缺点，开辟了消退肉芽肿的新思路。研究结果不仅对当前血吸虫病的治疗具有重要的临床意义，而且为利用透皮给药系统治疗其他类似疾病提供重要的理论基础和实验依据。 关键词 ：
10、血吸虫病 虫卵肉芽肿 吡喹酮 透皮给药 作用机制 华中农业大学 2012 届硕士研究生学位论文 2 Abstract Schistosomiasis is a very important parasitic helminth disease which is a serious threat to the development of livestock and the health of people in the word. The granulomatous reaction induced by the schistosome eggs present in tissues of t
11、he liver and intestine resulting in the destruction of tissues and formation of granuloma. Furthermore, the granulomatous in liver induce hepatic fibrosis and cirrhosis which finally result in death of the patients. So, its thought that if the formation of granuloma could be suppressed, the overt di
12、sease might be cured. Considering the special pathological structure of the schistosome egg granuloma, we designed the system of transdermal drug delivery which can make the anti-schistosomiasis drug praziquantel across the barriers of skin and granuloma. We prepared the PZQ transdermal agent which
13、drug concentration was 3000mg/ml. Firstly, we made the toxicity test to determine the appropriate dose of transdermal drug delivery, then made animal experiment to explore the effect of PZQ via transdermal delivery on schistosoma japonicum egg granuloma. We determined the appropriate dose of transde
14、rmal drug delivery by the toxicity test and found that toxicity to liver by transdermal administration was weaker than by oral administration at the same dosage. Compared with blank group, the average destiny and volume of egg granuloma of transdermal administration group were reduced more than 80%
15、and 50% respectively. With the data of granulomatous in transdermal administration group, oral administration group and blank group, we can proved that PZQ can not only kill the schistosomal adult worms but also have the suppressing effect that suppress inflammatory cells within the granulomas. Besi
16、des, we researched the physical and chemical properties, mixture ratio, solution and oil-water partition coefficient of EGPE, THF, OA, DMSO, 1,4-dioxane to develop mixed transdermal agent with multi-component which may have better effect of transdermal performance. With the research, we found that t
17、he DMSO-1,4-dioxane and DMSO-THF have the value of deep research. Transdermal drug delivery system of PZQ avoids the disadvantages of oral administration and opens up new idea to subside granuloma. The results of the research hvae important clinical significance on current treatment of schistosomias
18、is, besides, they 吡喹酮透皮给药对日本血吸虫病虫卵肉芽肿的影响 3 provide important theoretical basis and experimental evidence to the use of new drug delivery system of treating other similar diseases. Key words: Schistosomiasis; schistosome egg granuloma; Praziquantel; Transdermal delivery; mechanism of action 华中农业大学 20
19、12 届硕士研究生学位论文 4 缩略语表 缩写符号 英文名 中文名 PZQ Praziquantel 吡喹酮 EGPE Ethylene glycol phenyl ether 乙二醇苯醚 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲亚砜 THF Tetrahydrofuran 四氢呋喃 OA Oleic acid 油酸 TDDS Transdermal drug delivery system 透皮给药系统 吡喹酮透皮给药对日本血吸虫病虫卵肉芽肿的影响 5 1 前言 1.1 日本血吸虫病及防治现状 血吸虫病（ schistosomiasis）是一种严重危害人类 、牛羊等哺乳动物 健康
20、的寄生虫病 。 目前全世界约有 2 亿人被感染，每年造成约 28 万人死亡，在全球 76 个国家大约共有 7.8 亿人受到血吸虫病威胁（ Sayed A et al., 2008; Shadan S, 2008）。我国目前仍有 30 多万血吸虫病患者，近万头耕牛受到感染血吸虫（雷正龙等，2010）。血吸虫的种类较多， 寄生于 人的主要有 3 种：埃及血吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫。 这三种血吸虫病流行的区域也不一样，血吸虫大部分流行于亚洲东部和西部、中东、非洲、中南美洲等地区。中国是受日本血吸虫危害最为严重的国家之一，在我国肆虐的只有日本血吸虫一种，但日本血吸虫被认为是 最难防治的血吸虫种类，
21、该病 流行于长江流域及其 以 南的 12 个省（市、自治区），受威胁的人群达 1 亿。 宿主 由 于 皮肤接触含尾蚴 的 疫水而 被 感染，血吸虫 在体内生长发育为成虫并 寄生在 宿主的 门静脉系统 ，排出的虫卵引起 肝与结肠 产生肉芽肿反应。血吸虫病 严重破坏 人体重要的内脏器官 ， 打破机体的代谢平衡，患者丧失劳动力，对人体产生非常严重的危害，如果放任其发展，最终将导致患者死亡。 1.1.1 血吸虫概述 吸虫纲 （ Trematoda） 、绦虫纲 （ Cestoidea） 和涡虫纲 （ Turbellaria） 三者组成了扁形动物门。涡虫纲 为自主生活而吸虫纲和绦虫纲为寄生生活。血吸虫是吸
22、虫的一类，具有吸虫某些共有的特征。动物学家认为吸虫的祖先经过亿万年与软体动物接触，适应与遗传变异，并发展成为螺类的寄生虫。原始吸虫不仅在螺类宿主消化道内可以生存，发育，甚至进行有性生殖，并且出现了第二宿主或者第三宿主。 血吸虫的生活史分卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫、成虫等 7 个阶段。成虫雌雄异体，生活状通常是雌雄合抱。 日本血吸虫成虫寄生于人或 哺 乳动物的 血管中，成熟雌雄虫合抱交配，在 肠壁的小血管中产卵 ， 雌虫每天产卵 20003000 个，这 些虫卵在肠壁血管内发育成熟。大部分虫卵 随血液沉积于 肝脏， 小 部分虫卵 通过破坏的 肠壁 落入 肠腔随粪便 一起 排出体外。虫卵
23、在水中孵化出毛 蚴 ，毛 蚴 钻入 钉 螺并在螺体内 依次 发育成胞 蚴和 尾蚴 。成熟的尾 蚴钻出钉螺体外 ，浮游 于 水 体表面 ，脱去尾巴 钻入皮肤转 变成童虫，童虫进入血管 移至门静脉系统 处 寄生， 22 天后发育为成虫， 周而复始， 这就是血吸虫的生活史 ，如图 1-1 所示 。 华中农业大学 2012 届硕士研究生学位论文 6 尾蚴经皮肤感染 变成成虫至 交配产卵一般 需要 30天。 血吸虫 成虫在宿主体内 一般存活 2 5年 。 随血液循环 移至门静脉 终宿主（人、牛等哺乳动物） 钻入皮肤 中间宿主（钉螺） 水中发育 图 1-1 日本血吸虫的生活史 Fig.1-1 The li
24、fe history of Schistosoma japonicum 1.1.2 血吸虫病发病机制 在血吸虫感染的整个过程中，由于虫体各个阶段抗原的刺激诱发宿主一系列免疫学应答及其相应的病理变化，其中血吸虫虫卵是最主要的致病因素，导致的虫卵肉芽肿是最严重的危害。从免疫学角度分析，血吸虫病实际上是一种细胞免疫和体液免疫均参与的 虫卵肉芽肿性疾病。 尾蚴及童虫所致病变：血吸虫尾蚴钻进皮肤后数小时至 1-2 日，可引起尾蚴性皮炎。患者皮肤出现红色丘疹，真皮内毛细血管扩张充血，伴有出血和水肿，病灶周围有中性、嗜酸性粒细胞及组织细胞浸润。童虫移行经过肺肝时，可引起肺部组织点状出血及白细胞浸润，病灶的规
25、模与感染的程度成正比，这种血管炎性病变又称为童虫性肺炎。 成虫及其代谢物所致病变：发育成熟的血吸虫成虫消化道及生殖器官分泌的排泄物及代谢产物作为抗原持续地进入宿主体内，与相应的抗体形成免疫复合物沉积于器官，造成疾病。常见的有静脉内膜炎、静脉周围炎 及栓塞性静脉炎。 血吸虫虫卵所致病变：血吸虫肉芽肿的形成是可溶性抗原诱导、 T 细胞介导的迟发型超敏反应。致敏的 T 细胞再次受到同种抗原刺激后产生各种淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等聚集在虫卵周围，形成肉芽肿。随着病情的发展，卵内毛蚴死亡、虫卵钙化吸收，肉芽肿周围的类上皮细胞变成纤维细胞，产生胶原纤维，肉成虫 童虫 尾蚴 子胞蚴 母胞蚴 毛蚴 卵
