1、 目录号：CL （120T ）microRNA qRT-PCRSybgreen Detection K上海冠泰生物技术有限公司上海市闵行区罗锦路 98 号 2 号楼 502 室Tel: 021-51692391E-mail: Contents and Storage（组分及贮存）货号试 剂 说 明 120T储存条件CL- -A15逆转录 Buffer 1 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -A2高效逆转录酶 50ul/支 1 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -A3重组 RNA 酶抑制剂 35ul/支 1 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -A4dNTP mix 120ul
2、/支 1 支 -20 度（可以稳定至少一年）CL- -A5 dd 水（ Rnase 和Dnase free） 1.25ml/支 3 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -A6 特异性茎环逆转录引物（10） 120ul/支 1 支-20 度（可以稳定至少一年）CL-B Biotnt 荧光染料 PCR Premix 1.25ml/支 3 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -C1 real time PCR 上游引物（10 ） 720ul/支 1 支-20 度（可以稳定至少一年）CL- -C2 real time PCR 下游引物（10 ） 720ul/支 1 支-20 度（可以稳定至少一
3、年）合计 13 支Introduction（简介）产品简介：MicroRNA，MicroRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码 RNA 分子，大约由 2125 个核苷酸组成。这些小的 miRNA 通常靶向一个或多个 mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标 mRNAs 而调节基因的表达。成熟的 microRNA 的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为 pri-microRNA 的初级转录物；动物 pri-microRNA 的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为 70 个核苷酸左右并能形成茎-环结构的 microRNA 前体，称为 pre-microRNA；第二次剪切
4、位于细胞质中，pre-microRNA 被剪切成 21-25 个核苷酸成熟的 microRNA。图，pre-microRNA 和 microRNA 示意图试剂盒系统简介：microRNA qRT-PCR Sybgreen Detection Kit 包括了三部分，PartA 为 RNA 进行逆转录的所有成分，包括一种全新高效逆转录酶、反应缓冲液及该实验中必需的反应组分；使用该试剂盒能够以 microRNA 为模板, 通过茎环引物合成 microRNA 的 cDNA 第一链，可以用于 120 个 RNA 进行逆转录合成 CDNA；Part B 为 real time PCR 的染料 Premix
5、，该 premix 经过优化，可以适合以 microRNA 为模板转录的 CDNA 进行的 real time PCR 实验；Part B 提供了充足的 Premix，可用于 CDNA 进行 360 次 real time PCR 实验； Part C 为 real time PCR的特异性上下游引物，以及可以用做质控的阳性 CDNA 模板；另试剂盒中提供一支 RNA 酶，DNA 酶free 的双蒸水，可用于 360 次体系的配制。注意： 本试剂盒用于成熟的 microRNA 的逆转录。提供的组分足够用于 120 次特异性 CDNA 的逆转录和 360 次real time PCR 实验。警告
6、： 本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等其他用途。安全提示：本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，请勿直接接触皮肤或吞咽；操作时请穿戴实验服、防护镜和手套；如果接触皮肤，应立即用洗涤剂和大量清水冲洗；误食或其他危急情况，请及时到医院就治；部分试剂易燃，请注意消防安全。ID accession 序列 Product NameMethods（方法）其他需要自己准备的：1仪器：混匀器，PCR 仪，离心机（冷冻）；移液器（10L ，200L，1000L）；冰盒；2耗材：1.5mL Eppendorf 管（无菌、无酶、RNase-free；货号 A2010B0X04）Tips(RNase
7、-free)（1000L 、200L 的枪头；货号 A2010B0X09）；3DEPC ddH2O（Biotnt 统一货号 A2010B0X01）：也可以自己配制。配法如下：配 1000ml 的 DEPC 处理水，超纯水 1000ml， 加 1ml 100DEPC，磁力搅拌器搅拌过夜 。第二天高压蒸汽灭菌 121 度，25min DEPC 分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。最好分装小瓶来用，尽量避免污染；4手套，口罩。试剂盒使用注意事项：1用于 cDNA 合成反应的溶液试剂尽可能用 DEPC 进行处理，并在高压灭菌后使用，有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌器具、水等配制溶液后，再将溶液进
8、行过滤除菌处理；2RNA 样品要避免基因组 DNA 污染；3避免多次反复冻融 RNA；4试剂盒的各组成成分应在-20 保存；5cDNA 产物应置于-20 保存，或者保存于-80 度，可以保存 6 个月。预防 RNase 污染，应注意以下几个方面：1经常更换新手套，以防止 RNase 污染；2使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染；3RNA 在 Trizol 试剂中时短时间内不会被 RNase 降解，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在 150烧烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5M NaOH中浸泡 10 分钟，然后用 DEPC 水彻底清洗，再灭菌
9、，即可去除 RNase） ；4配制溶液应使用试剂盒提供的 RNase-free ddH2O。进行完整的 microRNA real time PCR 实验，除了本品，还需要购买的其他产品：Biotnt MicroRNA 内参 qRT-PCR sybgreen Detection Kit 的 Part CAssay principle（实验原理）一、使用 Biotnt 茎环系统 microRNA real time PCR assay, 采用的是两步 RT-PCR；1逆转录第一步：使用试剂盒中提供的特异性的茎环逆转录引物和 Biotnt 茎环系统逆转录试剂盒进行逆转录，得到 CDNA；2real
10、 time PCR 第二步：请使用 microRNA real time PCR assay 提供的特异性引物，以及 Biotnt的 Real time PCR 染料法 Premix；图 2 Biotnt microRNA RT-Real time PCR 示意图Assay Procedure（实验流程）一、逆转录步骤1. 在 0.5ml 微量离心管中（无菌无 RNA 酶，货号 A2010B0X04），加入总 RNA 1g（如果不计算浓度值，直接加入 1 ul RNA）；注：总 RNA 中应含有小 RNA(small RNA)；总 RNA 的量应在 1ng-5ug 之间；如果采用特殊的专门抽提
11、小 RNA 的试剂盒，RNA 的量应在 0.1ng-1ug 之间；2. 配制 逆转录反应体系货号 名称 10ul 体系CL- -A1 5逆转录 Buffer 2 lCL- -A4 dNTP mix 1 lCL- -A3 重组 RNA 酶抑制剂 0.25 lCL- -A2 高效逆转录酶 0.4 lRNA 1ul CL- -A6 特异性茎环逆转录引物（10） 1ulCL- -A5 补水 4.35ul 总体积 10ul注：如果 n 份 RNA 要进行 microRNA 的逆转录；建议增加 10%的余量，以便进行分装；举例，如果有 10 个样本要进行人 的逆转录和内参 U6B 的逆转录；建议各配 11
12、 个人份；货号 10ul 体系 步 骤CL-A15逆转录 Buffer 2 L 44ulCL-A410mM dNTPmix 1 L 22ulCL-A3重组 RNA 酶抑制剂0.25 L 5.5ulCL-A2高效逆转录酶0.4 LA 部分配 22 人份，分装到 20 管中，每管 3.65ul8.8ulCL-A6特异性茎环逆转录引物（10） 1ul11ul 各自CL-A5补水4.35ul B 部分配 11 人份；配 11 人份 U6B；分别加入到 A 分装的 20 管中，每种加 10 管；47.85ul 各自RNA 1ul 每管加 1ul 每管加 1ul总体积 10ul1) 混匀後，42反应 60
13、min；95 度 5 分钟；2) cDNA 产物如不马上进行 real time PCR 实验，应置于-20保存。或者保存于-80 度，可以保存6 个月。二、real time PCR 实验1. mix 的配制：货号 名称 20ul 体系CL-B Biotnt 荧光染料 PCR Premix 10CL- -C1上游引物（10） 2CL- -C2下游引物（10）2CL- -A5dd 水（Rnase 和 Dnase free）5合计 191) 部分仪器，如 AB 的 7900 和 stepone 等，可以使用 5-10ul 的反应体系；以上体系可以等比例缩小使用；2) 本试剂由于加入了化学修饰法的
14、热启动 taq 酶，所以可以室温下进行配制；不需冰上操作；3) real time PCR 进行相对定量实验时，请按照如下方法计算和配制：设置阴性对照和阳性对照；各 1 孔，共两孔；如样本需要进行内参验证或者预实验，可以进行单孔实验；正式数据建议用双复数据或者三复数据根据需要配制的孔数，再多配 10%的液体量；2. 把混好的 mix 每孔 14ul 加入仪器配套的 PCR 反应板或者 8 连管中；3. 按照计划，样本孔，每孔加入 1ul 已经逆转录好的 CDNA；阳性对照孔加入 1ul -CDNA 阳性模板（CL- -C3）；阴性对照孔加入 1ul dd 水，使总体积为 20ul；注：CDNA
15、 样品如果浓度过高，可以进行稀释使用；方法见附录；4. 上机前，请在 2000 转左右离心 10s-30s，以便液体甩到底部；5. real time PCR 上机: 1）适用荧光定量 PCR 仪：AB，BIORAD IQ 系列,Opticon 系列 ROTORGENE,STRATAGENE 等品牌。注意： ROCHE 品牌的 lightcycler 仪器由于光路不同，需要进行调试。AB 系统仪器， Biorad IQ 系列仪器可以完全参照以下的条件：95 5 分钟95 5s 6030s（读荧光）熔解曲线分析40 个循环（可选）Biorad opticon 系列和 CFX， Rotorgene
16、 可以参照以下条件：95 5 分钟 95 5s 60 30s 72 5 s（读荧光）熔解曲线分析40 个循环（可选）其他仪器请根据自己的特点进行优化；注意：本 mix 中的 taq 酶是化学修饰法的 hot start 酶，95 5 分钟这一步骤必须保留；2）熔解曲线分析的设置： 由于本试剂盒采用原理是 sybgreen 染料法进行荧光检测，所以扩增结束必须进行熔解曲线分析； 熔解曲线分析的设置每台仪器都略有区别，请参照使用仪器的设置方式；以 AB 公司的 stepone plus 为例， 扩增和熔解曲线设置如下：95 5 分钟 95 5s 6030s（读荧光） 95 15s ；72 30s（
17、升温 0.3/s ） ；95 15s40 个循环3）退火温度设置：本试剂盒为已经优化好的退火条件。不同的 microRNA 由于组成不同，设计的引物不同，可能导致的退火温度不完全一致。购买 Biotnt 经过验证的 microRNA assay， 里面提供的上下游引物都是经过优化和验证的；绝大多数实验条件基本相同。4）实验质控：应用 Biotnt microRNA 茎环系统 assay 的内参 assay， 逆转录的 CDNA 进行 real time PCR，得到的扩增曲线和熔解曲线，其 CT 一般应在 27 以内，熔解曲线为单峰。使用试剂盒中提供的阳性模板（CL- -C3）得到的 real
18、 time PCR 实验数据，CT 应该在 27 以内；熔解曲线为单峰；峰的位置在 80 度左右，见本试剂盒提供的示意图；使用试剂盒中提供的阴性对照（CL- -A5）得到的 real time PCR 实验数据，扩增曲线应该基本不起跳，CT 应该大于 35；无熔解曲线峰或者是一片杂信号；5）阳性模板的扩增曲线和熔解曲线示例：appendix（附录）附录 1.real time PCR 体系配制和加样作为 microRNA 的目的基因，在实际的应用中，经常要与内参基因的检测搭配使用。举例：如果采用三复孔，有 10 个样本，两个目的基因，1 个内参基因，则需要配制 32 孔的目的基因 A 反应液，
19、32 孔的目的基因 B 反应液 和 32 孔的内参基因反应液；加到 96 孔反应板中，加 30 孔的目的基因 A 反应液，30 孔的目的基因 B 反应液 和 30 孔的内参基因反应液；剩余的基因 A /B / 内参基因各加一管阴性（即 CDNA 由水来替代）。每次计算要做的目的基因和内参基因数量，以及样本数进行反应体系 mix 的配制；建议根据实际的加样孔多 10%的方式进行计算各部分体积，配制好后进行分装；如果内参 CT 值低于 15， 而目的基因的 CT 值也在 20 之前的情况，CDNA 可以稀释使用；附录 2.实验数据分析举例举例：对胰腺组织抽提得到的 100ng 总 RNA 模板，采
20、用 Biotnt microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit 和 U6B 特异性 microRNA assay,所得到的扩增曲线和熔解曲线。上图的右图中，tm=80.45 度的峰，为内参基因 U6B 的特异峰；左边 79 度的峰，为 的特异峰；使用 Biotnt microRNA assay 中提供的茎环逆转录引物进行逆转录得到的 CDNA， 一般长度在70bp 左右；经过特异性上游引物和下游引物扩增出来的产物片段在 60-70bp 之间；Tm 在 76-82度之间；每个 microRNA assay 中都提供了阳性的 CDNA 模板，并提供了一份经验证的报
21、告，包括扩增曲线图和熔解曲线图；注意，同一种 microRNA 熔解曲线的峰应位于同一位置；实验结果： 阴性样本扩增曲线基本不起跳（或者 CT34） ；阴性样本的熔解曲线无目的产物峰；阳性模板（Biotnt microRNA assay 提供）和阳性样本有 S 型扩增曲线；阳性样本的熔解曲线有单一的目的产物峰（与 Biotnt microRNA assay 中提供的熔解曲线产物峰位置相同或者相近： tm相差在 2 度以内） ；实验结果有效；如果实验有异常情况，请把您实验的阳性模板情况（扩增曲线和熔解曲线）提供给 Biotnt，以便帮您分析实验过程中出现的问题。采用相对定量法进行数据结果的计算：
22、Biotnt microRNA assay 与 Biotnt microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit 结合使用，扩增效率接近 100%；可以应用相对定量法进行计算。计算方法如下：目的基因的 CT 值取平均值；内参基因的 CT 值取平均值；delta CT=目的基因的 CT 均值 -内参基因的 CT 均值；计算每一个样本的 2-delta CT，作为相对定量 RQ 值。同组的 RQ 值可以进行加和，取均值，或者计算 SD。关于电泳与熔解曲线的验证：建议客户尽量不要对扩增的产物进行电泳验证。由于 microRNA 扩增后的产物片段只有 60-70bp，电泳要
23、打开扩增管盖，扩增产物很容易挥发到空气中，形成气溶胶，导致实验室 PCR 产物污染。建议客户观察熔解曲线，并与 Biotnt 提供的熔解曲线进行对应，一般不同的机器 Tm 会有差异，但不会超过 2 度。附录 3.Trouble shooting问题 解决样本没有扩增曲线 查看仪器设置，是否设置正确的荧光读板时间，不同机器有不同的读板方式；即使没有扩增，也会有荧光检测曲线；ABI 机器在部分错误设置时，不能显示正确的扩增曲线；ABI 机器可以查看仪器的原始荧光信号；样本没有熔解曲线 查看熔解曲线设置是否正确；杂乱的熔解曲线 可能没有产物；查看 Biotnt microRNA assay 提供的阳性 CDNA 对照进行 real time PCR 扩增结果如何；熔解曲线峰与 Biotnt microRNA assay 中提供的 tm 值不一致与公司的技术部联系阴性对照有扩增曲线，且熔解曲线峰与目的产物峰相同被污染，注意加样和 PCR 的防污染措施品质保证：所有产品由 Biotnt 进行品质保证。如果客户使用中有任何问题，都可以联系 Biotnt 公司。电话: 4008801880 或 021 51692391 传真： 021 51692391技术服务专线: 18116409458Email: 主页： 在线支持 QQ 群： 47468567
