1、 1 亲们： 曾老师发来的实验讲义， 请 下载打印，每次课带相应的讲义。 1.下周一实验 1 点开始，切记时间不要迟到哟。 2.作业：第一次（今天）的实验报告，还有 “大吞噬 ”和 “小吞噬 “的图。 3.漂亮美女们要把头发扎好，为自己的健康着想哟。 实验一 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验 【原理】 吞噬细胞具有对异物 (细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等 )吞噬和消化的功能，在机体固有免疫中发挥重要作用。 【目的】 1. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察， 加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。 2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘 眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。 【材料】 小鼠、 2鸡 RBC（ C
2、RBC）、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、弯头眼科镊 、 1mL注射器 【方法】 10的硫乙醇酸钠溶液腹腔注射 1ml（诱导腹腔巨噬细胞大量渗出） （ 4d） 2 CRBC 腹腔注射 1ml （ 45min） 摘眼球放血，处死小鼠 轻揉腹部 1min，剪开表皮，暴露腹膜，剪一小口，取腹腔液（用尖吸管）滴于玻片一端 推片（自然干燥） 瑞氏染色（ 10min） 冲洗，印干，镜检 【 注意事项 】 腹腔注射时勿注入皮下； 染色时玻片勿互相碰触； 观察 时注意玻片正反 面 。 结果： 吞噬百分率吞有 SRBC 的吞噬细胞 /100 个吞噬细胞 100 吞噬指数所吞 SRBC 数 /100 个吞噬细胞
3、2 附： 2%CRBC 悬液 的制备：吸取在阿氏液中保存的 CRBC 沉淀 0.3mL，置于玻璃试管内，加入 2mL 生理盐水，混匀， 2000rpm, 5min 离心，此为洗涤红细胞。离心毕，观察上清，如无溶血现象，即可弃上清，取红细胞沉淀（即为压积红细胞） 0.2mL，移入 15mL 离心管中，以 10mL 注射器吸取生理盐水 10mL 加入，混匀，即为 2%CRBC 悬液 。若洗一次后仍可见溶血现象，则重 复第一步，直至无溶血发生，方可配制实验用红细胞悬液。 摘取胸腺，脾脏 。均为重要的 免疫器官，做 动物 实验获取免疫细胞的重要来源 示教片： 大吞噬实验：即本实验结果； 小吞噬实验：
4、外周血嗜中性粒细胞吞噬葡萄球菌（标本片示教） 实验 二 淋巴细胞转化实验（ MTT 法） 一、原理： 四甲基偶氯唑盐（ MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的 MTT 还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的 OD 值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平 。 二、材料： 小鼠、 鼠板、眼科剪、眼科镊、 75%乙醇 湿棉球、 小 平皿、 200 目筛网、研棒 （注射器针芯） 、细胞计数板、盖玻片、 加样器（ 1mL、 200uL、 20uL）及枪头、 96 孔血凝板、 15mL 离心管、4mL EP 管、 96 孔板
5、、 白细胞计数液、 MTT、 ConA、无菌 PBS、 Tris-NH4Cl、完全 1640(含 10% FBS、 1%双抗 )、 0.01N HCl-10%SDS、无菌针头过滤器、 10mL 注射器、 废物（液）缸、 冰浴 、无菌操作台、 CO2 培养箱， 显微镜、 酶标仪，冰箱 、低温离心机。 试剂的准备： 1. MTT： 称取 50mg 的 MTT，溶于 10ml PBS 后，终浓度为 5mg/ml，过滤除菌，无菌EP 管分装， 1mL/管， -20避光保存。 2. ConA： 25mg/瓶， Sigma 出品。取 25mg，溶于 25mLPBS 中，终浓度为 1mg/mL，过滤除菌，无
6、菌 EP 管分装， 1mL/管， -20保存。用时取 1mL，以无菌 PBS 稀释为 100ug/mL（即稀释 10 倍）。 3. PBS：取市售配好的 PBS 粉末一袋，加 1000mL 蒸馏水，混匀，高压或过滤除菌， 4保存。 4. 0.01N HCl-10%SDS：设市售浓 HCl为 10N（实 际约为 11N），取 0.1mL加 99.9mL 蒸馏水稀释为 0.01N HCl 100mL；称取 10g SDS，置于 100mL 量筒内，以上述 HCl 溶解，使终体积为 100mL，即得 0.01N HCl-10%SDS。 5. 完全 1640:取市售 RPMI1640 89mL，加 1
7、mL 100双抗、 10mLFBS，即得含 10%FBS 的完全 1640. 3 6. Tris-NH4Cl（ 红细胞裂解液 ） ： 称取 3.735g 氯化铵、 Tris（三羟甲基氨基甲烷） 1.3g加水溶解并稀释至 500ml。 0.22m 滤膜过滤除菌， 4 保存。 无菌 器械的准备： 1. 200 目筛网、研棒、 平皿 ：提前 1d 高压灭菌，烘干备用。 2.手术器械：临用前酒精擦拭或浸泡、酒精灯火焰灭菌。 3.冰浴：将碎冰置于一白色浅盘 (或小塑料泡沫盒 )内，备用。 （三） 实验 方法： 1、脾细胞制备： （ 1）小鼠 摘眼球放血、 脱 颈椎处死， 75%乙醇 湿棉球擦拭腹部 ，置
8、于 鼠板 上 固定； （ 2）在小鼠腹 部 中 间部位 剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （ 3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏， 另一镊子 分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有 5ml 无菌 PBS 液的培养皿中； （ 4）制备脾细胞悬液 : 无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（ 200 目）上，置于盛有适量无菌PBS 的小平皿中，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经 200 目筛网过滤，用PBS 洗 3 次，每次离心 2000r/min 5min。取出 10l，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，调整细胞浓度为 5 106/ml。 细胞 计
9、数 的方法： 稀释脾细胞：在 96 孔血凝板内分别加白细胞计数液 90L/孔，根据细胞数量加 2-3个孔；取脾细胞悬液 10L，依次 10 倍稀释 。 取最后 1 孔的 细胞悬液 10L 置于白细 胞记数板槽内，待细胞不再移动， 100 倍镜下进行细胞计数。 1m m 1 m m 0. 1m m =0. 1m m3= 0. 1 10- 3m l =10- 4ml细胞浓度 :细胞数 / m l =5 个中格的细胞数 x 5 x 1 04（ R B C 计数法）细胞数 / m l = 4 个大格的细胞总数 / 4 x104 （ W B C 计数法）WWWW 1mm根据细胞计数结果，取适量细胞以完全
10、 1640 稀释为 5 106/mL 2、淋巴细胞增殖反应： 将 5 106/ml 脾细胞悬液加入到 96 孔培养板中， 100ul/孔， 加 6 个孔 ， 再加培养液 100L/孔；前 3 个孔 加 ConA 10L/孔 (终浓度 5g/mL)，另 3 个孔不加 ConA作为对照。置 5 CO2， 37培养 72h。 4 3. 在培养结束前 4-6 小时， 先将各孔中培养液小心吸出 100L/孔，注意 加样器枪头勿碰触细胞； 于培养板各孔内加入 5mg/ml MTT 液， 10l/孔。 37培养。 4. 4-6 小时后， 各孔内加入 0.01NHCl-10%SDS 100l, 振荡摇匀， 3
11、7过夜。 5. 用酶标测定仪测 OD 值，测定波长 570nm。 抄录数据。 （四） 实验结果 取 实验组和对照组三个复孔的 平均 OD 值。 转化值 =实验组的平均 OD 值 -对照组的平均 OD 值。 注意事项 （ 1）由于本实验需要培养 3 天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。 （ 2）细胞操作要轻柔、迅 速，以免细胞损伤影响实验结果。 （ 3）为保持细胞活性，所有步骤（除破坏红细胞时）均需在低温或冰浴中进行。 实验 三 -1 凝集实验 原理：是 颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应 (agglutination)。 细菌和红细胞等颗粒性抗原
12、，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下， 两者特异性结合且进一步 聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。反应中的抗原称为凝集原（ agglutinogen），抗体称为凝集素（ agglutinin）。 分类：直接凝集试验、 间接凝集试验、间接凝集抑制试验等 血 球凝集试验：属 直接凝集试验 材料： 1 SRBC、 1： 20 溶血素、生理盐水（ NS）、 24 孔凹孔板、 0.2mL 加样器及枪头、37恒温箱 方法与步骤：对倍稀释法（第 12 孔为阴性对照， 37， 2h， 4 静置过夜 1 2 3 4 5。 11 12 生理盐水（ ml） 0.2 0.2 0.2 溶血素（ m
13、l） 0.2 0.2 0.2 弃去 1： 40 1： 80 1： 160 1%SRBC（ ml） 0.2 0.2 0.2 结果判定： 全部凝集，血细胞明显凝集，甚至成片卷曲，上清清亮 两者之间，血细胞凝集成片，上清发红，略不清亮 一半凝集，一半沉淀，血细胞均半数凝集，周围散在颗粒，上清呈混悬 两者之间，血细胞在孔底形成一圆点，周围可见少量凝集，上清更加浑浊 一点儿也 不凝集，血细胞在孔底形成边缘整齐，光滑的点状，上清澄清 效价： 即 滴度 ，是 出现明显凝集现象 （） 的抗体的最大稀释度。 5 实验 三 -2 抗体形成细胞检测 溶血分光光度计法 QHS 实验原理 ： 定量溶血分光光度法 (qu
14、antitative hemolysis spectrophotometry， QHS) 该法又称 B 细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由 B 细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白 (以吸光值表示 )，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与 SRBC 及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37水浴 1 小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。 实验材料 ： 5%SRBC、 SRBC（以生理盐水 稀释成 1.5 108/ml）、 补体（三只 豚鼠血清混合，以 SRBC 4 吸收 30 min， 3000rpm 离心 15mi
15、n，上清 1:10 稀释备用 ） 2 107/ml 小鼠脾细胞、 RPMI1640 培养液、白细胞计数液、 Tris-NH4Cl 溶液、酒精棉球 200 目铜网、针芯（研棒）、冰浴（置于中号白托盘中）、 眼科剪、弯头眼科镊 2把、平皿（小号）、小滤器、 10mL 注射器、 PBS、低温离心机、 15mL 离心管、 1.5mL 离心管若干、 96 孔血凝板（稀释细胞用）、 96 孔酶标板、各规格（ 1mL、 200uL、 10uL）加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物（液）缸、 37孵箱、酶标仪 实验方法： 1. 脾细胞的制备 5%SRBC 免疫小鼠， 1mL/只， 4 天后拉颈处死，
16、取脾 200 目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液， 2000rpm 离心 5min，弃上清 Tris-NH4Cl 室温作用 10min， 2000rpm 离心 5min,弃上清 洗细胞 2 遍： 加 5ml PBS 液，混匀， 2000rpm 离心 5min，弃上清 加 1 ml PBS 液计数，调整细胞浓度为 2 107/ml 按下表分别向各管中加入所需材料 实验管 对照管 脾细胞 0.2 ml 0.2 ml PBS 液 SRBC 0.2 ml 0.2 ml Complement 0.2 ml 0.2 ml 混匀， 37 孵育 1 h 3000rpm 离心 5 min，取上清 ，加入 96 孔
17、板， 0.1mL/孔，实验组和对照组各设 3 个复孔 酶标仪 测定 413nm 处 OD 值（ Hb 量） 6 实验 四 7 8 9 实验 五 免疫细胞化学 实验原理 ： 应用免疫学基本原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry)或 免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry)。 免疫酶标记法 ： 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；
18、酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。 1、常用的标记酶及其显色底物 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)及底物 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP)及底物 (1) 辣根过氧化物酶 (HRP)及底物 HRP 是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无 色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约 40kDa，稳定性好； 底物为过氧化物和供氢体 (DH2) 过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。 供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是 DAB。 DAB (二氨基联苯胺
19、) DAB 本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。 目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。 (2) 碱性磷酸酶 (AP)及底物 AP 为磷酸酯的水解酶，可通过两 种反应显色： - 偶氮偶联反应，底物为 -萘酚 磷酸盐 ，经水解后得 -萘酚 ， 与重氮化合物如坚牢蓝 (fast blue)或坚牢红 (fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。 靛蓝 -四唑 反 应： 底 物为 溴 氯 羟吲 哚 磷酸 盐 (5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑 (NBT)在此氧化过程中被
20、还原成不溶性紫兰色沉淀。 酶标抗体法 通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成 有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。 优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。 缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。 (1)直接法 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原 -抗体 -酶复合物，最后用底物显色剂显色。 (2)间接法 将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗 (酶标抗体 )与复合物中的特异抗体结合，形成抗原 -抗体 -酶标抗体复合物
21、， 最后用底物显色剂显色。 实验材料 ： 1 107/ml 小鼠脾细胞、 单抗（兔抗鼠 CD3）、兔 Streptavidin-HRP 试剂盒（带DAB 显色液）、 小牛血清 、 淋巴细胞分层液（适用于小鼠组织）、 白细胞计数液、酒精棉球 、10 200 目铜网、针芯（研棒）、冰浴（置于中号白托盘中）、眼科剪、弯头眼科镊 2 把、平皿（小号）、 PBS、低温离心机、 15mL 离心管、 96 孔血凝板（稀释细胞用）、各规格（ 1mL、 200uL、10uL）加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物（液）缸、 37孵箱、 湿盒 实验方法： 1. 单个 脾细胞的 制备 取健康 ICR 小鼠，
22、 18-22g，摘眼球放血、脱颈椎 处死，取脾 200 目铜网上研磨脾脏，收集脾细胞悬液， 2000rpm 离心 5min，弃上清 用 PBS 洗 3 次，每次以 500 rpm 短时低速离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网过滤去 除 细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为 (2 5) 107/ml。常温下放置，分离前用 小 牛血清悬起细胞浓度为 l 107/ml 的单细胞悬液备用。 2. 分离单个核细胞 取 上述单细胞悬液 1ml，小心加于 2ml 的细胞分离液之液面上 以 2000 转 /分离心 (半径 15cm 水平转子 )15 分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为胎牛血
23、清液层。 第 二 层 ； 为环状乳白色淋巴细胞。 第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层 。 收集第二层细胞放入含 PBS 4-5 毫升的试管中，充分混匀后，以 2000 转 /分离心 5 分钟。沉淀经反复洗 2 次即得所需细胞。 附： 1. 有关淋巴细胞分层液的 注意事项 : 1） 启封后应置 4保存避免微生物的污染。 2） 细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用。 3） 整个分离过程中，温度应控制在 18-28且 在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。 2. 细胞计数要点： 1） 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 l04 个 /ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。 如果细胞团 10，说明细胞分散不充分；或细胞数 500 个 /10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 2） 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3） 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意 每次取样都要混匀， 以求计数准确；
