1、 博士学位论文1博 士 学 位 论 文生长素调控气孔发育的功能和作用分子机理研究博 士 生：指导教师：专 业： 植物学所在院系： 农业与生物学院上海交通大学年 月博士学位论文2生长素调控气孔发育的功能和作用分子机理研究摘 要由于植物不能移动，它需要根据不断变化的环境调整生理活动，以完成必要的生长发育过程。气孔存在于植物表皮，是二氧化碳和水分进出植物体的主要通道，是植物体与环境交流的桥梁，参与维持环境中二氧化碳与水分的平衡。因此，气孔的发育情况与植物体的生长发育息息相关，特别是光合作用。经过多年的研究，许多关键的调控气孔发育的信号因子渐渐被发现，包括胞外信号肽 EPF 家族，细胞膜蛋白与激酶 T
2、MM 和 ER 家族，胞质激酶MAPK/MKK/MAKKK 家族及细胞核内的 bHLH 和 MYB 型转录因子等。其中，EPF 家族成员 STOMAGEN 是迄今为止被发现的唯一参与正调控气孔发育却不表达于表皮细胞的因子，即 STOMAGEN 基因表达于叶肉细胞，其编码产物stomagen 肽被分泌至表皮层发挥正调控气孔发育的功能。植物体内及体外环境的一些因素已被发现参与调控气孔发育过程，包括二氧化碳、光及植物激素中的油菜素内酯（BR ） 。生长素（Auxin）是最早被发现的植物激素，它主要通过结合核受体 TIR1/AFB 家族及生长素调节子 AUX/IAA 家族形成的共受体，促进生长素响应因
3、子 ARF 家族对生长素响应基因的转录调节而参与调控植物生长发育的方方面面。但目前对于生长素是否参与气孔发育的调控仍不得而知。本研究首次发现生长素参与负调控气孔发育，并揭示了这一过程是由核受体介导的生长素信号转导途径介导，最终通过生长素响应因子ARF5/MP（MONOPTEROS）直接负调控气孔发育的上游正调控因子编码基因STOMAGEN 的表达，从而负调控气孔发育。通过气孔表型分析，我们发现过量表达 iaaL（编码产物使内源游离活性生长素含量降低）的转基因植株，以及生长素合成途径关键酶的突变体 taa1 tar1 tar2、生长素核受体突变体 tir1 afb1 afb2 afb3、生长素信
4、号抑制因子编码基因IAA12 的获得性突变体 bdl、生长素信号响应因子 ARF5 突变体 arf5 的气孔密度显著增多，呈现气孔簇的表型。ARF5 蛋白的组织定位分析显示，该蛋白在叶博士学位论文3肉细胞表达，而在表皮细胞无表达。鉴于 STOMAGEN 在叶肉细胞表达，其产物运输至表皮细胞促进气孔发育，因此本研究分析了 ARF5 与 STOMAGEN 表达的关系。结果表明：在 taa1 tar1 tar2、tir1 afb1 afb2 afb3 和 arf5 突变体中，STOMAGEN 表达显著上调。基因序列分析发现， STOMAGEN 启动子-500 bp 至-1bp 范围内含有 6 个典型
5、的生长素应答元件 AuxRE 序列。通过 EMSA、ChIP-qPCR 等分析，我们发现 ARF5 直接与这些 AuxRE 结合。遗传分析表明，STOMAGEN 位于 ARF5 的遗传学上位参与正调控气孔作用。因此，本研究揭示了生长素参与调控植物生长发育的新功能，即气孔发育；及其相关的分子机理，即生长素与其共受体 TIR1/AFBsAUX/IAAs 结合，促进 AUX/IAAs 的降解而解除 AUX/IAAs 对 ARF5 的转录抑制作用，导致 STOMAGEN 表达的下调，从而抑制气孔发育。这项研究不仅拓展了对生长素的生理功能的认识，而且揭示了生长素与多肽激素信号交互作用调控细胞分裂与分化的
6、机理，对于其他植物激素与多肽激素信号间的互作机制研究具有借鉴意义。关键词：拟南芥，气孔发育，生长素，ARF5，STOMAGEN博士学位论文4The Molecular Mechanism and Function of Auxin Regulating Stomatal DevelopmentAbstractPlants, as sessile organisms, must coordinate various physiological processes to adapt to ever-changing surrounding environments. Stomata, the ep
7、idermal pores facilitating gas and water exchange, play important roles in optimizing photosynthetic efficiency and adaptability, as well as global carbon and water circulation. Many factors are involved in regulating stomatal development, including EPF family peptides, TMM/ER family membrane protei
8、n/kinases, MAPK cascade kinases, and bHLH/MYB transcriptional factors. STOMAGEN, as a member of EPF family, is expressed in mesophyll instead of epidermis, and its encoding peptide then migrates to the epidermis where it is proposed to promote stomatal development by competitively inhibiting TMM/ER-
9、mediated signaling. The phytohormone brassinosteroids and environment factors, such as light and carbon dioxides, also control stomatal production. Auxin, as the first identified phytohormone, participates in many aspects of plant growth and development, but whether auxin regulates stomatal developm
10、ent is unknown.This study establishes that auxin negatively regulates stomatal development through ARF5/MP (MONOPTEROS) repression of mobile peptide gene STOMAGEN expression in mesophyll cells, which is mediated by direct binding of ARF5 to auxin response elements in the STOMAGEN promoter.We observe
11、d significantly increased SMI (stomata plus meristemoids per total epidermal cells) and stomatal clusters in epidermis of iaaL, taa1 tar1 tar2, tir1 afb1 afb2 afb3, bdl, or arf5 mutant / transforming plants. ARF5 protein localizes in mesophyll cells, instead of the epidermis, consisted with STOMAGEN
12、 expression. Genetic analysis indicates that ARF5 regulates stomatal development, at least in part, 博士学位论文5through repressing STOMAGEN expression. From qRT-PCR analysis, histochemical staining, and Dual-LUC assay, we found that ARF5 regulates STOMAGEN expression depending on AuxREs in STOMAGEN promo
13、ter. ChIP and EMSA assays indicate that ARF5 directly associates with AuxREs in STOMAGEN promoter. This study advances our knowledge about the roles of auxin and the versatile regulator ARF5 in plant growth and development, while providing a paradigm of cross-talk between phytohormone auxin and pept
14、ide signaling in the regulation of stomatal production.Key words: Arabidopsis, stomatal development, Auxin, ARF5, STOMAGEN博士学位论文6目录摘 要 .5目录 .9缩略词表 .12第一章 文献综述 .141 拟南芥气孔发育的研究进展 .141.1 气孔的产生与进化史 .141.2 拟南芥气孔发育途径的重要因子 .181.2.1 EPF 家族成员负调控气孔发育 .181.2.2 LRR 型膜受体激酶及蛋白负调控气孔发育 .221.2.3 MAPK 级联激酶负调控气孔发育 .23
15、1.2.4 胞外、胞内蛋白酶在气孔发育调控中的作用 .241.2.5 转录因子正调控气孔发育 .251.2.6 “极性因子”在气孔发育调控中发挥的作用 .291.3 气孔发育与环境的互作 .321.3.1 二氧化碳浓度与气孔发育 .321.3.2 光与气孔发育 .331.3.3 油菜素内酯（Brassinosteroids，BR）与气孔发育 .342 生长素的合成、运输和信号转导途径 .352.1 生长素的合成途径 .352.1.1 从头合成 .362.1.2 代谢产生 .412.2 生长素的运输途径 .412.2.1 生长素的输入 .422.2.2 生长素的输出 .422.3 生长素的信号转
16、导 .452.3.1 生长素介导的转录水平调控 .452.3.2 生长素介导的非转录水平调控 .50第二章 实验材料与实验方法 .521 材料 .521.1 菌株与原始质粒 .521.2 植物材料 .521.3 构建 .531.4 试剂与仪器 .562 实验方法 .592.1 PCR 反应 .592.1.1 Taq DNA 聚合酶 .59博士学位论文72.1.2 KOD DNA 聚合酶 .592.2 载体构建 .602.2.1 限制性内切酶法 .602.2.2 融合法 .602.2.3 DNA 突变 .612.3 大肠杆菌转化 .612.4 质粒的提取 .632.5 农杆菌转化 .642.6
17、拟南芥种植 .652.7 拟南芥转化 .652.9 拟南芥基因组 DNA 的提取 .662.10 气孔表型分析 .672.10.1 利用微分干涉显微镜 .672.10.1 利用激光共聚交显微镜 .672.11 RNA 的提取和定量 RT-PCR .672.12 组织免疫学染色 .692.13 染色质免疫共沉淀（ ChIP） .702.14 蛋白的表达与纯化 .732.15 Western 检测 .752.16 DNA 与蛋白的体外免疫沉淀（DNA-protein pull-down） .772.17 电泳迁移率实验（ EMSA） .782.18 烟草瞬时转化 .792.19 LUC 与 Dua
18、l-LUC 实验 .80第三章 实验结果与结论 .811 生长素及其信号通路负调控气孔发育 .811.1 外源生长素处理抑制气孔发育 .811.2 内源生长素水平的升高抑制气孔发育 .821.3 内源生长素水平的降低促进气孔发育 .831.4 核受体介导的生长素信号抑制气孔发育 .851.5 ARF5 负调控气孔发育 .861.6 ARF5 调控气孔发育及胚胎根发育成正相关性 .881.7 IAA12 正调控气孔发育 .892 ARF5 抑制气孔发育始于气孔发育早期 .903 ARF5 介导的生长素信号抑制 STOMAGEN 的表达 .913.1 ARF5 蛋白表达于叶肉细胞 .913.2 干
19、扰生长素的体内合成促进 STOMAGEN 的表达 .924 STOMAGEN 位于 ARF5 的遗传学上位参与调控气孔发育 .995 ARF5 直接结合 STOMAGEN 启动子区域 .1015.1 ARF5 与 STOMAGEN 启动子区在体内相互作用 .1015.2 ARF5 与 STOMAGEN 启动子区在体外直接相互作用 .1025.3 ARF5 与 STOMAGEN 启动子区的直接的相互作用依赖于 AuxREs 顺式元件.1046 ARF5 调控 STOMAGEN 的表达依赖于 AuxREs 顺式元件 .1066.1 在烟草瞬时表达系统中， ARF5 调控 STOMAGEN 的表达依
20、赖于博士学位论文8STOMAGEN 启动子的-500 bp 至-1 bp 区段 .1066.2 在烟草瞬时表达系统中， ARF5 调控 STOMAGEN 的表达依赖于STOMAGEN 启动子上-500 bp 至-1 bp 区的 AuxREs 元件 .1086.3 在拟南芥中，ARF5 调控 STOMAGEN 的表达依赖于 STOMAGEN 启动子上-500 bp 至-1 bp 区的 AuxREs 元件 .108第四章 讨论与展望 .1111 生长素及其核受体介导的信号通路参与负调控气孔发育 .1112 生长素及 ARF5 对 STOMAGEN 表达的负调控可能具有时效性 .1123 烟草与拟南
21、芥系统中 ARF5 对 STOMAGEN 表达调控方向的不一致性 .1134 ARF5 可能主要以非细胞自主性方式参与负调控气孔发育 .1145 ARF5 参与调控气孔发育的其他途径 .1156 ARF5 参与调控垫基细胞发育 .1167 ARF5 可能是生长素调控叶片生长、发育与生理活动的一个效应因子 .1168 ARF 家族的其它成员参与负调控 STOMAGEN 表达 .1179 IAA12 等 AUX/IAAs 参与抑制 MP 对气孔发育的调控 .11710 核受体介导外的生长素信号通路与气孔发育 .11811 生长素调控气孔发育的新进展 .11812 生长素与肽激素间的新交流 .119
22、第五章 创新点 .121参考文献 .122附录 .137致谢 .错误！未定义书签。研究成果 .146博士学位论文9缩略词表List of Abbreviation缩写 英文全称 中文全称IAA Indole Acetic Acid 吲哚乙酸BR Brassinosteroids 油菜素内酯bp base pair 碱基对kb kilo base pairs 千碱基对cDNA complementary Desoxyribose Nucleic Acid 互补(链 )脱氧核糖核酸qRT-PCR Quantitative Reverse Transcription-PCR 定量反转录 PCRDMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DNA Desoxyribose Nucleic Acid 脱氧核糖核酸DPG Days Post Germination 萌发后
