1、江 西 中 医 学 院20 届毕业论文论文题目：吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响课题来源：国家课题 论文性质：应用基础研究学生姓名：XXXXXX 学生学号：XXXXXXXXXX所在班级：XXXXXXXXXXXXXXXXX 院 XXXXXXX 班导师姓名：XXXXXXXXXXXX 导师职称：XXXXXXXXX 导师电话：XXXXXXXXXXXX 导师签名：XXXXXXXXXXXX实习单位：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX单位地址：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX完成时间：XXXX 年 XX 月江西中医学院毕业论文1目 录一、论文1、标题和作者？2、中文摘要及关键词？
2、3、英文摘要及关键词？4、前言？5、正文？6、讨论或小结？7、参考文献？8、文献综述？9、致谢及声明？二、导师评阅意见表（单张）三、优秀论文申报表（单张） 、优秀导师申报表（单张）四、实习总结（单张）五、优秀实习生申报表（单张） 、优秀实习组申报表（单张）六、平时成绩表（单张）江西中医学院毕业论文2吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响中文摘要目的：本试验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功能各指标变化的角度，探索吴茱萸对机体呼吸功能的调控机制，以证实吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响。方法：采用 Clark 氧电极法测定大鼠肝脏线粒体在密闭反应体系中耗氧的变化，以确定线粒体耗氧速率。结
3、果：与空白组比较，给药组有较高的 RCR，差异显著。结论：吴茱萸组通过加快态呼吸耗氧速率，降低态耗氧速率而提高 RCR。关键词 吴茱萸； 肝脏线粒体； 呼吸功能ABSTRACTPurpose:To prove the effect of Evodia rutaecarpa on the respiratory system of mitochondria in mouse liver,the indes of these have been detected,and also the Regulatory mechanism.Methods:The Clark oxygen electrode
4、 is used to test the change of oxygen ,which consumed by mitochondrium in mouse liver ,to calculate the rate of the consumption of mitochondrial oxygen. Result: Compared with the blank group, the administration group have a higher level of RCR, and the difference was obvious. Conclusion：Evodia rutae
5、carpa is helpful to the higher level of RCR,by accelerating the rate of the oxygen consumption of state ,and reducing that of state .Key words Evodia rutaecarpa；liver mitochondria; respiratory chain function前 言现代实验已证实,寒证的出现可能与人体能量代谢降低有关，由于能量代谢降低，身体热量不足，体温较低，呼吸缓慢，心跳减慢，心搏出量减少，体表毛细血管及小动脉反射性收缩，大脑皮层兴奋性减低
6、而产生上述一系列“寒”的证候 1。温里药具有温中散寒、补火助阳、回阳救逆等功效，通过提高能量代谢对于寒证患者有很好的调节作用。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，属热性中药代表，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。生物能量是维持机体生命的重要物质基础，能量代谢是人体物质代谢的最基本形式。线江西中医学院毕业论文3粒体是细胞活动的主要供能场所，是物质代谢和能量转化的中心站 2。线粒体通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)生成大量ATP供应细胞内各种化学反应与功能的能量需要 3。本实验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功
7、能各指标变化的角度，探索吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响，以期探讨热性中药影响能量代谢的途径与机制。正 文1 试验材料1.1 试验动物 健康雄性SD大鼠40只，体重220士20g，由江西中医学院实验动物中心提供。动物质量合格证编号:SCXK（赣）20060001；将大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只动物，分别为吴茱萸20天组、吴茱萸30天组、吴茱萸40天组、空白组。试验期间动物均饲养于同一环境下，保持室温1824，环境安静，动物随意进食进水，空白组给等体积生理盐水。所有动物于试验前12h禁食，但自由饮水。1.2 试验药材 吴茱萸，购自北京鹤元堂医药科技有限公司。1.3 试验试剂 蔗糖（
8、solarbio） 、甘露醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司） 、EDTA-2K（国药集团化学试剂有限公司 批号：F20080423） 、KCl（上海实验试剂有限公司 批号：200805025） 、KH 2PO4（天津市福城化学试剂厂 批号：20080913） 、Tris（solarbio） 、HCL（上海焱晨化工实业有限公司） 、线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术研究所） 、考马斯亮蓝 G-250（sigma 公司） 、琥珀酸钠（sigma 公司） 、ADP-2Na（sigma 公司） 、Janusgreen B（sigma 公司） 、95%乙醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司 批号：2009
9、0123） 、85%磷酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司 批号：20081203） 。1.4 仪器设备 782-1Channel Oxygen system（Strathkelvin Instruments） ， 低温高速离心机（Thermo） ，-80冰箱（Thermo ） ，DY89-型电动匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司） ，SC-15数控超级恒温槽（宁波新芝生物科技股份有限公司） ，722型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司） ，Gilson P型移液器，Sartorius PB-10 PH计，ELGA purelab UHQ超纯水机，分析天平（1/100、1/1000、1/10
10、000、1/100000） （Sartorius） 。2 试验方法2.1 实验试剂配置2.1.1 线粒体呼吸功能反应介质：称取 4.0991g 的甘露醇、2.5673g 蔗糖、0.1211g Tris 、0.0020g EDTA-2K、0.0373g KCL、0.0680g KH2PO4(PH=7.4)用双蒸水定容至 100ml。江西中医学院毕业论文42.1.2 线粒体提取缓冲液：称取 21.393g 蔗糖、0.151g Tris、0.101gEDTA-2K；(PH=7.4)用双蒸水定容至 250ml。2.1.3 底物（0.4M 琥珀酸纳）：称取 1.62g 琥珀酸钠用双蒸水定容至 25ml。
11、2.1.4 50mM ADP：称取 0.02365gADP-2Na 用双蒸水定容至 1ml。2.2 吴茱萸水煎剂的制备 取 2.0kg 吴茱萸药材，加入 10 倍量水，浸泡 60min，回流提取 60min，倒出药液，残渣再加入 8 倍水，回流提取 60min。合并两次药液，滤过、浓缩后制成吴茱萸水提液，制备成生药浓度为 0.42g/ml，放置于-20冰箱保存备用。2.3 大鼠肝脏线粒体的制备2.3.1 大鼠实验前禁食12小时,动物麻醉后，迅速手术、切取肝脏组织。2.3.2 肝组织处理：迅速取出肝脏，移入 25ml 烧杯加入足量带冰渣生理盐水，将肝组织剪碎，清洗积血以尽可能减少残留血液。清洗完
12、后迅速用滤纸吸干后用万分之一分析天平称取150mg 肝脏组织，将称好的组织转移至预冷的玻璃电动匀浆器中，加入线粒体分离试剂，（注意：分离试剂要保存在 4的冰水浴中） 。2.3.3 匀浆：用玻璃电动匀浆器匀浆， （注意：匀浆器应置于冰水浴中） 。2.3.4 离心：将匀浆分装在 2 个 1.5ml 的离心管内，平衡离心，4下以 600g 离心 5 分钟，此时细胞核，红细胞和细胞碎块及各种细胞器分布在不同层次，轻轻倒出上清装进两个离心管内， （注意：倾倒时必须小心勿将底部的细胞核倒出以保证所制备线粒体的纯度） ，平衡后11000rpm 离心 10 分钟，将大部分上清倒出，所得褐色沉淀为最后制备的线粒
13、体。取少量保存介质，将沉淀悬浮起来，用较大的 Tip 头缓慢的吹打均匀，操作中尽量避免出现气泡，取样测定蛋白浓度，此为最后制备的线粒体悬液， （整个线粒体制备过程均在 4进行） 。2.4 线 粒 体 活 性 鉴 定2.4.1 JanusgreenB 染 色 原 理 ： JanusgreenB 是 对 线 粒 体 专 一 的 活 细 胞 染 料 ， 具 有 脂 溶性 ， 能 跨 过 细 胞 膜 ， 解 离 后 ， 有 染 色 能 力 的 基 团 带 正 电 ， 结 合 在 负 电 性 的 线 粒 体 内 膜 上 ，内 膜 上 的 细 胞 色 素 氧 化 酶 使 染 料 保 持 氧 化 状 态 ，
14、 呈 蓝 绿 色 ， 而 在 胞 质 内 染 料 被 还 原 成 无色 。 有 活 性 的 线 粒 体 被 染 成 蓝 绿 色 4。2.4.2 0.02%JanusgreenB 配 置 :称 取 0.02g 的 JanusgreenB,用 生 理 盐 水 定 容 至 100ml,装入 棕 色 瓶 中 。江西中医学院毕业论文52.4.5 载 玻 片 的 制 备 ： 在 载 玻 片 上 滴 一 滴 线 粒 体 溶 液 ， 再 滴 一 滴0.02%JanusgreenB， 混 匀 ， 然 后 盖 住 盖 玻 片 。2.4.6 线 粒 体 活 性 检 测 ： 将 光 学 显 微 镜 预 热 20min
15、， 再 对 制 备 好 的 载 玻 片 进 行 观 察 。结 果 显 示 :视 野 中 有 大 量 呈 蓝 绿 色 游 动 的 颗 粒 ， 提 示 提 取 的 线 粒 体 有 较 好 的 活 性 。 见 图1。图 1 在 光 学 显 微 镜 40下 观 察 用 Janusgreen B 染 色 的 线 粒 体2.4 线粒体蛋白定量 52.4.1 线粒体蛋白含量用 Bradford 法进行蛋白含量的测定，用标准的牛血清白蛋白作标准曲线，室温下测试。具体步骤为：试剂准备：100mg 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml95%乙醇中，再加入 100ml85%的磷酸，用蒸馏水定容至 1L,混匀，用滤纸
16、过滤，4保存备用准备各种不同浓度的牛血清白蛋白标准液，2.5ug/100ul，5.0ug/100ul，10.0ug/100ul，20.0ug/100ul，14.0ug/100ul，每个浓度做三个样，以标准蛋白含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图，即得到一条标准曲线。见图 2。y = 6.1099x + 0.0044R2 = 0.99700.050.10.150.20.250.30 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05标 准 蛋 白 含 量 (mg)吸光度系 列 1线 性 (系 列 1)江西中医学院毕业论文6图 2 蛋白定量标准曲线计算待测蛋白样品的浓度。取 4 支试管，1
17、支作空白，3 支留作测定管，分别加入生理盐水：100ul、60ul、60ul、60ul，向后 3 支测定管中加入 40ul 的线粒体提取液，使每支试管总体积为 100ul。最后各试管中分别加入 3.0ml 考马斯亮兰 G250 染色液，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除） 。待测蛋白以及标准蛋白中加入 3ml中的考马斯亮蓝，用漩涡混合器混匀后静置 2 分钟，用 722 型可见分光光度计分别测量其在 595nm 处的吸光度值。2.4.2 加完试剂后室温下静置 25 分钟后，分别倒入 0.5cm 光径玻璃比色皿中，用可见分光光度计在波长为 595nm 处
18、测定各样品的 OD 值，空白对照为第 1 号试管，即 100ul 双蒸水加 3.0mlG-250 染色液。 2.4.3 根据标准曲线方程计算待测蛋白的浓度。2.5 线粒体呼吸功能检测 6（Strathkelvin 782 氧电极法）2.5.1 预热生物测氧仪 30 分钟，恒温 30。2.5.2 调节氧电极，用保险粉测试电极探头，确保仪器设施良好，可用于样品的测定。2.5.3 在反应槽中加入 0.7ml 反应介质(75mmol/L 蔗糖、225mmol/L 甘露醇、0.05mmol/L EDTA-2K、5mmol/L KCl、5mmol/L KH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl)加
19、入反应池中孵育 2min，以空气饱和（反应温度 28） ，使仪器稳定 810mins，调节仪器将最大相对氧浓度值设定为 20 左右。测定介质量反应总体积（23ml）肝脏线粒体悬浮液体积琥珀酸体积ADP 体积。2.5.4 加入 0.1ml 肝脏线粒体悬液(含 0.1mg 线粒体蛋白)，记录一段时间基线，1min 后加入反应底物 10l(0.5mol/L 苹果酸钠、0.5mol/L 丙酮酸钠)28温浴 1 min,出现 IV 态呼吸。2.5.5 记录约两分钟后，加入 0.1mol/L ADP 5l,出现 III 态呼吸，记录氧耗曲线，待ADP 完全消耗后线粒体又恢复到 IV 态呼吸。2.5.6 R
20、CR 即加入 ADP 加入后(态呼吸, ST3)和 ADP 耗尽后(态呼吸,ST4)的氧耗量。RCR 反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。P/O 值为反应体系中加入 ADP 的nmol 数与相应所消耗的 nmol 原子氧之比。2.5.7 线粒体呼吸活性以单位时间内每毫克线粒体蛋白消耗多少表示(nmolmin-1mg-1)。江西中医学院毕业论文73 结果3.1 大鼠肝脏线粒体呼吸耗氧曲线，见图3。图3 肝脏线粒体呼吸耗氧曲线图3.1.1 吴 茱 萸 对 大 鼠 态 3、 态 4 的 影 响 ： 见 表 1， 结 果 表 明 吴茱萸组能显著加快态呼吸耗氧速率，降低态呼吸耗氧速率， （P0.
21、01） 。表 1 吴茱萸对大鼠肝脏线粒体态 3、态 4 呼吸的影响3.1.2 吴 茱 萸 对 大 鼠 RCR 的 影 响 ： 见 表 2， 结 果 表 明 给 药 组 RCR 高 于 空 白 组 RCR， 可见 给 药 组 的 能 量 生 成 、利用及产热均高于空白组（P0.01） 。表 2 吴 茱 萸 对 大 鼠 肝 脏 线 粒 体 RCR 变 化 的 影 响组 别 N 剂量（g 生药/kg） RCR组 别 N 剂 量 （ g 生 药/kg）态3(nmolO2/min.mg.pro)态4(nmolO2/min.mg.pro)空 白 组 10 等 体 积 102.0416.30 25.533.
22、38吴 茱 萸 20 天组10 4.2 86.877.48 16.174.52吴 茱 萸 30 天组10 4.2 66.2013.49 17.293.71吴 茱 萸 40 天组10 4.2 118.7721.54 28.994.73江西中医学院毕业论文8空 白 组 10 等 体 积 3.770.27吴 茱 萸 20 天 组 10 4.2 5.641.35 吴 茱 萸 30 天 组 10 4.2 3.961.21吴 茱 萸 40 天 组 10 4.2 4.090.21 注：与空白对照组比较 P0.013.2 讨论线粒体是一切生物进行生命活动的动力之源，是所有真核生物进行能量代谢、产生ATP的重要
23、场所 7。线粒体的结构、功能变化必将引起其所在细胞的生物活性改变。要了解它的结构、功能变化就必需进行各种实验研究，首先就需要获得较为完整的线粒体。线粒体的提取主要是破膜以后使用梯度离心，利用沉降系数的不同获得线粒体。获得线粒体之后，需要检测线粒体的活性以确保获得的线粒体未受损伤。通常使用线粒体的呼吸控制率(respiratory control ratio)表示线粒体的活性。呼吸控制率是线粒体呼吸III态(StateIII，有呼吸底物和ADP)和呼吸IV态(StateIV，有呼吸底物，没有ADP)耗氧量的比值8。线粒体的呼吸耗氧偶联着ADP与Pi合成ATP的磷酸化反应，ADP/O值是指线粒体每
24、吸收一克原子氧的同时，生成ATP的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。呼吸控制率(RCR)与磷/氧(P/O)比值是反映磷酸化活性的重要指标，因而成为反映线粒体呼吸功能的主要指标 9，10 。本实验研究发现，从呼吸功能指标方面看,吴茱萸组肝线粒体呼吸过程中R3较空白组快,因而使吴茱萸组RCR值(R3/ R4)高于空白组，表明给热性中药吴茱萸后能增加肝脏线粒体的有效氧耗。本 实 验 的 结 果 ,考 虑 可 能 与 以 下 因 素 有 关 :1、 吴 茱 萸 产 地 不 同 是 否 会 影 响 本 实 验 结论 2、 本 实 验 只 研 究 了 时 效 药 物 对 大 鼠 肝 脏 线 粒
25、体 的 影 响 ， 缺 少 不 同 剂 量 下 药 物 对 大 鼠 肝脏 线 粒 体 的 影 响 ， 因 此 ， 需 要 增 加 剂 量 组 进 一 步 考 察 。本实验只是呼吸功能研究中的一小部分内容，在研究中尽管选择了一些方法，但与全面反应吴茱萸对机体的作用可能还有一段距离。有关线粒体呼吸功能的研究还有待进一步探讨。因此，有意义的呼吸功能的研究及分析方法的建立，在今后的研究中仍然是一个重点和难点。江西中医学院毕业论文9参考文献1 程彬彬中药四气的现代研究概况时珍国医国药，2000，11(9)：11-122 Kiberstis PAMitochondria make a comebackSc
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