1、 I摘要含硫化合物包括小分子硫醇，硫化氢和亚硫酸盐等，参与体内许多重要的生化反应进程，在生物生理活动过程中扮演着极其重要的作用。生物体内这些含硫硫化合物含量的改变和许多疾病相关，因此选择性检测这些含硫化合物特别是硫醇具有重要的意义。根据三种含硫化合物反应活性的差异，本文设计、合成了四个基于迈克尔加成反应机理的硫醇、硫化氢和亚硫酸盐探针，并在乙腈/水溶液体系测试了它们对硫醇及含硫化物的光谱响应，结果表明探针 TCF-Br 的反应活性最高，能快速、高灵敏地检测硫醇，其对生物硫醇的检测限为 0.17M。TCF-N 对亚硫酸盐具有较高的选择性，而TCF-S 对硫化氢和亚硫酸盐均具有较快的光谱响应。结合
2、三个探针可以实现对三种含硫化合物的选择性、高灵敏度检测。关键词：生物硫醇，亚硫酸盐，硫化氢，分子探针，迈克尔加成反应IIAbstractSulfur-containing compounds including small molecula thiols, hydrogen sulfide and sulfite, play vital roles in biological and physiological processes processes. The variations of the concentrations of these compounds biosamples are
3、ralated to some diseases, therefore, selective detection of these compounds is of great interests. According to the different reaction activities of these sulfur-containing compounds, we designed and synthesized four probes based on the Michael addition reaction mechanism. The spectral responses tow
4、ard different sulfur-containing compounds were performed in acetonitrile/water (1:1) solution. TCF-Br showed the highest activity toward all three sulfur-containing compounds. The detection of thiols was completed within 1 min. The detection limits of thiols were as low as sulfite from sulfide. Sulf
5、ite, silfide and thiols can be discriminated by these three probes.Keywords: sulfite; fluorescence probe; surfactant; Michael addition reactionIII目录1 文献综述 .11.1 分子探针概述 .11.2 硫醇识别和检测的意义 .31.3 传统硫醇检测方法 .41.4 荧光探针检测硫醇的方法 .41.5 本文设计思路 .152 探针分子的合成 .182.1 实验仪器及试剂 .182.2 合成方法 .183. 探针对三种含硫化合物的光谱响应 .233.1
6、溶液的配制 .233.2 TCF-Br，TCF-N 和 TCF-S 的吸收光谱 .233.3 探针 TCF-Br 对含硫化合物的光谱响应 .243.4 探针 TCF-N 对三种含硫化合物的光谱响应 .263.5 探针 TCF-S 的测试 .283.6 反应机理探索 .283.7 利用三种探针对含硫化合物的指纹识别 .294.结论 .305.参考文献 .31基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用11 文献综述1.1 分子探针概述1.1.1 分子探针定义简介分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生命过程中，分子识别起着极其重要的作用。但分子识别作为分子之间发生的事件，仍需要借助一定的技术
7、手段才能感知伴随分子事件发生所产生的物理或化学信号。探针，特别是荧光探针或影像技术就是实现这一目标的桥梁 1。探针是针对某种特定的目标物（生物分子或离子）进行（分子）识别的的探测器，它能够特异性的识别目标物，并可直接进行检测或带有可检测标记物的高效探测试剂。化学及生物学意义上的探针被称为化学探针或分子探针，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用并可被特殊的检测技术探知的分子。与一般的检测方法相比，探针技术具有许多特点，包括灵敏度高、专一性强，快速准确，特别是适合于实时检测和分子影像。这些特点使得探针成为现代生物学、医学和药学等领域中不可缺少的重要技术。2荧光探针的核心是将分子间的相互作用转变成易
8、检测的（颜色、吸收光谱、荧光）信号传递给外界。一般情况下，探针至少由两部分构成：一是具有反应或识别功能的部分；二是具有信号输出功能的部分。具有识别功能的部分可以是某种核酸或蛋白质等生物大分子，也可以是某种配体、底物、药物等有机分子，在探针中它们负责识别待测靶标分子。具有信号输出功能的部分称作荧光团或发色团，按荧光团可将荧光探针分为：香豆素类、荧光素类、罗丹明类、菁染料类、氟硼吡咯类和萘酰亚胺类。当探针的配体部分与某种金属离子结合时，会引起荧光团的荧光参数发生改变，从而得到靶标分子的信息。 3、41.1.2 荧光发射原理荧光物质在吸收入射光的过程中，吸收了光子的能量并释放出电子，释放出的电子从基
9、态跃迁到激发态，而处于激发态的分子并不稳定，因而电子会通过辐射跃迁和非辐射跃迁两种方式衰变返回到基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生了荧光和磷光。由于非辐射能量的损失，发射光子的能量一般小于吸收光子的能量，故而荧光物质的发射光谱波长通常要大于吸收光谱波长。根据不同的性质，电子跃迁可分为两大类，其一是有着光子释放的辐射跃迁，包括荧光和磷光两个过程，其二为没有光子释放的非辐射跃迁，能量以其它形式耗散，如系间窜跃、热转换、内转换等。荧光过程是指当分子从激发态通过发光释放能量直接回到基态的过程；磷光过程是指从分子从激发态经过三线态发光回到基态的过程。还有一种特殊的荧光称为延迟荧光，与正常的
10、荧光有着相同的光谱结构，但经历的过程不太一样。延迟荧光是指某些第一基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用2激发单重态跟第一激发三重态能级接近的分子先跃迁到三重态后，然后又被热激发到单重激发态而发射的荧光 5。1.1.3 比率型荧光探针设计的基本原理比率荧光测定技术是荧光分析中的一项重要技术，是指采用荧光探针在独立状态下发射波长处的荧光强度和与待测物反应后在另一波长处发射的荧光强度的比值作为检测信号来检测物质的一种方法 6。由于比率荧光探针以同样环境下测定的两个波长处荧光强度的比值作为信号参量，若有影响则两处的荧光强度都会发生同样的变化，误差相互抵消，比值基本不受外界影响，结果得到修正
11、，所以可有效消除探针、样品及设备等因素引起的数据失真，从而得到更准确的结果，同时也提高了探针测量的选择性、灵敏度、动态相应范围等 7-9。引起荧光信号变化所涉及的机理主要有荧光共振能量转移、光诱导电子转移、分子内电荷转移、激基缔合物的形成或消失、激发态分子内质子转移等 10。1.1.4 荧光共振能量转移基本原理荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指当其中一个荧光团（能量供体）处于激发状态时，会将其能量转移给相邻的分子（能量受体） ，从而引起能量受体的激发，实现能量由供体向邻近的受体转移的过程。两个荧光团要实现能量转移，需要
12、满足四个条件：其一，能量供体发射光谱和受体的吸收光谱要有一定的重合；其二，两个荧光团的距离一般小于 100 ；其三，能量供体的量子产率与能量受体的光吸收系数都要足够高；其四，供体与受体的偶极的相对取向要合适。荧光共振能量转移包含两种主要机制。一种是 Frster 共振能量转移（Frster resonance energy transfer, FRET） ，它是指供体单线态与受体单线态之间的共振能量转移，是荧光共振能量转移的最主要的机制。另外一种为德克斯特(Dexter)电子传递机制，它是指供体三线态与受体单线态之间的共振能量转移 11。1.1.5 激发态分子内质子转移机理当存在分子内氢键时，
13、分子受到光激发后，形成氢键的质子的酸性提高，使分子易发生激发态分子内质子转移（Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT）过程。可以发生 ESIPT 过程的分子一般含有羟基或氨基，被激发时，羟基或氨基上的质子转移至邻近的与之形成氢键的原子上，通常形成的是五元环或六元环（原子间距离一般不超过 2 ） ，从而由之前的醇式结构转变为酮式结构。激发态（不是基态）时所形成的酮式结构要比醇式结构稳定，所以其发射的荧光波长比原分子的波长要长 12。1.1.6 分子内电荷转移机理分子内电荷转移是指处于激发态的分子发生了电荷转移，其造成整个体系的正负基于
14、 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用3电荷分离，所以发生电荷转移的分子一定包含电子给体（doner）和电子受体（accepter） ，而且它们之间有共轭的兀键作为电荷转移的通道。因此典型的利用分子内电荷转移（ICT）过程实现检测的荧光探针主要就是荧光团上连有吸电子基和供电子基的推-拉电子体系，其识别基团往往是推-拉电子体系整体中的一部分。当识别基团与客体作用时，对荧光团的给电子能力或拉电子能力产生影响：当电子给体的给电子能力或受体的接受电子能力增强时，ICT 荧光染料的发射波长将发生红移。反之，蓝移。当识别基团位于供电子基团（如氨基）的一端时，与客体结合后会减少供体的供电子能力，从而导
15、致体系的共轭程度降低，能量升高，使吸收光谱蓝移，摩尔消光系数也随之减小。于吸电子基团一端时，与客体作用后，增强了拉电子基团的拉电子能力，使整个体系的电子流动性增大，能量降低，吸收光谱红移，摩尔消光系数增大，发射波长红移。处于激发态上的分子由于电荷转移而造成的电荷分离的状态，具有正负电荷复合而回到基态的趋向，所以是不稳定的。若这个复合过程发生辐射跃迁，就会伴随 ICT荧光发射。所以凡是能促使正负电荷复合的因素都会降低体系的能量，进而使 ICT 荧光光谱红移，反之蓝移 13。1.1.7 单体、激基缔合物机理如果两个相同的荧光团（主要是多环芳烃，例如葸、芘）之间的距离合适，且位置恰当，那么其中一个荧
16、光团受光照射变为激发态分子后，就容易和另外一个基态荧光团分子形成激基缔合物（excimer） 。荧光发射光谱也由原来的单体发射峰转变成波长更长、范围较宽的发射峰。激基缔合物的形成条件之一是激发态分子和基态分子间的距离必须合适 14，所以我们可以通过改变两个荧光团间的距离来控制激基缔合物的形成或分解，改变距离的方法之一就是改变分子间作用力及空间位置。因此当某一荧光团与待测分子作用后，分子间作用力势必会发生改变，从而实现对分子的检测。1.2 硫醇识别和检测的意义小分子硫醇在生命系统中有重要的作用。在生命体中有三种重要的含巯基的生物分子：Cys, Hcy, GSH,它们有类似的结构。通常细胞内硫醇浓
17、度的改变与一系列的疾病相关，如：白细胞缺失，牛皮癣，肝损伤，癌症，艾滋等。 15,16Cys（半胱氨酸） 是参与构成蛋白质的常见氨基酸中唯一具有自由巯基的组分，它的缺乏会导致一些疾病，如小儿生长发育迟缓，头发花白，水肿，嗜睡，肝损伤，皮肤损害和身体乏力。 17 Hcy（高半胱氨酸）的结构与半胱氨酸十分相近，仅比半胱氨酸多了一个亚甲基（-CH 2-） ，却赋予了两者截然不同的生理特性。Hcy并不是人体必需氨基酸，也基本不参与蛋白质的合成。Hcy在血浆中浓度的增高，会导致老年痴呆症的基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用4叶酸和维生素B12的缺失，也会导致心血管疾病，血液中Hcy的浓度还
18、和生殖缺陷，老年人的认知障碍有关等等。 18,19 GSH（谷胱甘肽）是由半胱氨酸、谷氨酸（ glutamic acid, Glu）和甘氨酸（glycine, Gly）三种氨基酸构成的小分子三肽，是细胞内含量最高的非蛋白硫醇，起到维持许多细胞生理功能作用，如维持细胞内氧化还原反应环境，异生物质代谢，细胞内信号转换和基因管理。 20因此，在生物样品中检测这些含巯基的生物分子就显得小分子硫醇在生命系统中有重要的作用。1.3 传统硫醇检测方法检测硫醇的常用方法有很多，如高效液相色谱法和毛细管电泳分离法结合 21不同的检测方式，通常都是较优的方法。类似的每种方法都由于设备花费很高，操作复杂性，样品处理
19、和检测时间有各自的局限，多种类的硫醇同时要测定提出了挑战。直接运用电化学技术来检测硫醇是一种简便的检测方法。然而，电化学氧化法直接检测含硫醇化合物有一定局限性，原因是大多数的含硫醇的生物还原物质有相似的氧化电势，使用的常用固体电极限制了它的选择性。另一方面，直接氧化硫醇的电化学方法检测速度慢且通常需要过高的电压。硫醇和指示剂之间电催化反应由于要达到很高的精度和实验条件的非常细小的调整抑制了电化学方法的广泛应用。 22,23其他质谱检测的方法像气相色谱质谱联用（GC-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）也运用在检测硫醇中。 24.25 质谱检测有特异性，因为它能实时监测离子碎片。同时具有灵敏性
20、，因为增强了信噪比，缩短了样品后处理和副反应，使得检测时长变短。然而，该方法仍有一些问题，如复杂的色谱仪器的使用，复杂的样品预处理及其检测步骤，样品的再现性差，特别是在复杂组分里如血浆，尿液等。 261.4荧光探针检测硫醇的方法近年来，有大量的硫醇检测试剂问世，这些试剂利用巯基在特定条件下所表现出的强亲核能力、还原能力以及与金属离子形成配位键的能力来对巯基化合物进行识别和检测，常见的反应机理主要包括以下几种：迈克尔加成反应，和醛酮的环化反应，磺酰胺和磺酸酯的裂解，硒 氮键断裂，二硫键的裂解，氧化还原机理等。1.4.1基于加成反应迈克尔加成机理的探针近几年已经得到广泛的发展，针对硫醇检测染色体荧
21、光探针的迈克加成的受体分子也得到广泛的研究。这些探针从机理来看可以分为四类。1,1加成机理：该机理是已知的某些含巯基的氨基酸进行1,1-加成反应与羰基形成新的环结构。基于这一概念，可以设计含有合适的荧光基团的醛或染料，与硫醇可以发生1,1- 加成。作为一个普通的例子，图1-1显示胱氨酸反应与醛的形成，在这种情况基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用5下，一个四氢噻唑环。使用这种方法，醛衍生物基于菲，咪唑，枝状生色团，萘酰亚胺，荧光素，若丹明，香豆素，和金属配合物已被开发作为硫醇探针。图1-1 硫醇1,1- 加成机理基于菲的探针1被 Tanaka27等人用作硫醇1,1-加成的化学传感体
22、，他们用这个探针检测了一系列氨基酸（半胱氨酸，蛋氨酸，赖氨酸，丝氨酸，脯氨酸，组氨酸)和谷胱甘肽在水和乙腈中的混合物。与半胱氨酸的反应在250nm 和380nm 处有吸收峰，然而其他氨基酸和葡萄糖不改变探针的发射谱。与 GSH 反应导致的荧光中只有很小的增加。当荧光强度30 min 后测，只有与胱氨酸提供的值明显高于空白反应（没有氨基酸）这些结果表明，这种荧光法检测半胱氨酸的选择性，并能够区分这从其他简单的硫醇的氨基酸。观察到的选择性的半胱氨酸的巯基反应的存在和相应的噻唑烷环形成的结果（图1-2 ） 。该探针也被用来在生物成像中的应用。如图探针1反应生成化合物2.图1-2.探针1与 Cys 的
23、反应两种偶氮染料（3和4） 28含有醛基是由 Huang 和 LIET 报道等。作为半胱氨酸和同型半胱氨酸的比色探针。增加浓度的 Cys 或 Hcy 水平的 DMF 溶液在蓝色的吸收带的移位从465到442 nm 的加入。 Cys DMF 水溶液的添加：4（9：1 V / V）在 pH 值为7（HEPES 缓冲液）在 515 nm 处的诱导在吸收强度降低，具有蓝移的峰值伴随出现在475 nm，对应一个颜色从粉红色到黄。4在 DMF 中的光学性质：水（91，vv）对其他氨基酸（苯丙氨酸，苏氨酸，精氨酸之外，他的，天冬酰胺，丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，亲，赖氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，遇
24、见，酪氨酸，色氨酸，谷氨酸，是进行了研究，但没有明显的光谱变化类似于那些在4半胱氨酸和同型半胱氨酸的蓝移被发现观察到的，表明噻唑烷和噻嗪衍生物的选择性形成4A 和4B 。基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用6图1-3探针3和4与半胱氨酸和同型半胱氨酸的反应1,2-加成反应：当烯烃或炔烃基团连接到一个吸电子基团，在亲核硫醇上可以发生迈克尔加成。这个基本的反应在耦合上有色或者荧光基团可以。使用这种方法，烯烃或炔烃连接吸电子基团如氰基，硝基支架，羰基，和信号单元如香豆素，马来酰亚胺，荧光，和丹等，已被称为巯基探针。如图1-4所示图1-4 1,2- 加成的机理如图1-5所示当化合物5处在缓
25、冲溶液中，在340 nm 时有较强的荧光，在430 nm 处有观察到的发射光。在加入半胱氨酸，同型半胱氨酸，谷胱甘肽，半胱氨酸和甘氨酸，发射强度增量为 CysGSH HcyCys- Gly。 29例如，在10倍的半胱氨酸或谷胱甘肽时发射增强，在量子产率的变化分别为0.0013和0.0010，没有发生带移。使用化合物6在类似实验条件下反应量子产率分别提高到0.0022和0.0016 。化合物5和6对于这些生化硫醇的选择性，已经通过制备不同种类的探针的探针得到探明，这些探针有的接上了赖氨酸，丝氨酸，苯丙氨酸，等氨基酸。在上述的巯基化合物的检测范围，这些化合物没有任何明显的干扰，即使在相对于探针10
26、0：1的摩尔比下。此外，化合物6比化合物5更有活性，可能是因为化合物6羟基对于临近烯基的质子给与能力使碳链更加靠近，从而使反应位便于被硫醇进攻。X=H 5 X=OH 6基于 TCF 的小分子含硫化合物探针的合成与应用7图1-5 探针5,6和硫醇的反应一种基于青色素的高选择性针对于 Hcy 和 GSH 近红外探针已经得以制备。在探针 7 中加入 Cys，在 775nm 的吸收带强度锐减，并且在 515nm 处出现新的吸收带 30。作者证实了从 7 到 CyAK 与半胱氨酸反应。 整个检测机理包括了 Cys 向丙烯酸单元的加成生成相应的硫醚从而进一步分子间环化成为 CyAK。在其他氨基酸中也研究了
27、探针的荧光显示能力，但是没有观察到荧光现象。值得一提的是，探针对于 Cys 的响应却在对于 Hcy 和 Gsh 时观察不到。这种差异可以归因为分子间反应的不同的动力学速率。分子间与 Cys 环化成为七元环的反应能够很好的和八元环匹配。在 Gsh 的例子中只有共轭的硫醚生成，因为三肽巨大的位阻阻碍了分子间的环化反应。该探针已经用于生物构图领域。图 1-6 探针 9 与 Cys 的反应1,3 加成反应：1,3-加成同样用于鉴别存在的硫醇，在这个部分，硫醇对醌和醌的类似物的加成反应已经被报道。如图 1-7 所示图 1-7 硫醇探针的 1,3-加成机理化合物 10 被 Zhang 课题组用作硫醇的比色探针 31。探针 10 在 582nm 处有强烈的ICT 带在和 Cys 加成后，由于硫醇基团和探针琨的部分发生加成反应，使琨变成相应的对苯二酚，ICT 带的强度开始降低。同样，在和 GSH 加成后，ICT 的强度也出现减小的现象。作者也发现和 Cys 相比，探针和 GSH 反应的 ICT 带强度减少的更加缓慢，这可能是前者的空间位阻更大的原因。
