1、落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用 目 录 摘 要 . IABSTRACT . I引 言 . 11 试 验 材 料 与 方 法 . 21.主 要 试 剂 . 2.2 仪 器 与 设 备1.3 主 要 试 剂 配 制 方 式 . 31.3.1 落 新 妇 苷 纳 米 硒 合 成 所 需 溶 液 .2 清 除 羟 自 由 基 所 需 溶 液 . 31.3.还 原 力 测 定 所 需 溶 液.4 清 除 超 氧 阴 离 子 所 需 溶 液 . 31.3.5标 准 溶 液 . 42 试 验 方 法 . 42.1 落 新 妇 苷 的 纳 米 合 成 . 42.1. 高 效 液 相 色 谱 法 对 落 新
2、 妇 苷 纳 米 硒 的 定 性 和 定 量 分 析 .2紫 外 可 见 分 光 光 度 法 鉴 定 落 新 妇 苷 纳 米 硒 的 合 成 . 42.1.3 傅 里 叶 红 外 光 谱 分 析 法 鉴 定 落 新 妇 苷 纳 米 硒 的 合 成2. 抗 氧 化 试 验 . 52.1 清 除 羟 自 由 基 .2清 除 超 氧 阴 离 子 . 52.3 还 原 力 的 测 定 . 63 结 果 与 分 析 . 63.1 落 新 妇 苷 的 纳 米 合 成 . 63.1. 高 效 液 相 色 谱 法 对 落 新 妇 苷 纳 米 硒 的 定 性 和 定 量 分 析 .2 紫 外 可 见 分 光 光
3、 度 法 鉴 定 落 新 妇 苷 纳 米 硒 的 合 成 . 73.1.3傅 里 叶 红 外 光 谱 分 析 法 鉴 定 落 新 妇 苷 纳 米 硒 的 合 成 83.2抗 氧 化 试 验 . 3.2.1 羟 自 由 基 清 除 力 的 测 定 8. 超 氧 阴 离 子 清 除 能 力 的 测 定 . 93. 还 原 力 的 测 定 .4 结 论 . 10参 考 文 献 . 1致 谢 . 12 落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用I摘 要以落新妇苷作为表面修饰剂制备纳米硒溶胶，通过紫外可见分光光度法、傅里叶红外色谱分析法对落新妇苷纳米硒进行表征，并利用高效液相色谱法测定落新妇苷纳米硒中落新妇苷的
4、具体含量；最后通过对羟自由基、氧自由基清除能力及还原力的测定，评价落新妇苷纳米硒溶胶的抗氧化活性。结果显示，与落新妇苷原料相比，落新妇苷纳米硒的紫外特征吸收峰及傅里叶红外光谱中的羟基均发生偏移，证明落新妇苷成功修饰在纳米硒表面；通过高效液相色谱法测得落新妇苷纳米硒中落新妇苷的浓度为 0.197 g/mL；抗氧化实验中以落新妇苷、Vc 做阳性对照，发现落新妇苷纳米硒溶胶对羟自由基和氧自由基的清除力显著提高，且随着落新妇苷纳米硒浓度的增大而增大，同时落新妇苷纳米硒的还原力也有明显提高。本次实验说明落新妇苷成功修饰在纳米硒材料上后，极大的发挥了落新妇苷的生物学价值，增加了落新妇苷的利用率，为落新妇苷
5、的生物应用提供了新的思路和方法。关键词：落新妇苷纳米硒；高效液相色谱法；紫外可见光光度法；傅里叶红外色谱分析法；抗氧化性落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用IIAbstractNami was prepared by using astilbe chinensis as surface modifier, and the selenium was characterized by UV-vis spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy ( FTIR ). the content of astilbe chinens
6、is in Nami was determined by HPLC Finally, the antioxidant activity of astilbe chinensis nanoparticles was evaluated by the determination of hydroxyl free radical, oxygen free radical scavenging and reducing power. The results showed that compared with astilbe chinensis, the ultraviolet characterist
7、ic absorption peak of astilbe chinensis and the hydroxyl group in Fourier transform infrared spectrum indicated that astilbe chinensis was successfully modified on the surface of Nami Determination of astilbe chinensis in selenium Nami by high performance liquid chromatography .The concentration of
8、astilbin measured astilbin nano selenium by HPLC was 0.197 mu g/mL; antioxidation experiment in astilbin and Vc as positive control, found that the scavenging capacity of nano selenium sol by astilbin on hydroxyl radical and oxygen free radicals increased significantly, and increases with the drop o
9、f astilbin Nanoselenium at the same time, the concentration of the reducing power of astilbin nano selenium can be improved significantly. This experiment shows that astilbin successfully modified in nano selenium material, exerts its biological value of astilbin, increase the utilization rate of as
10、tilbin, provides new ideas and methods for the biological application of astilbin.Keywords: astilbin nano selenium; HPLC; ultraviolet visible spectrophotometry; analysis of Fourier transform infrared chromatography; antioxidation落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用1引 言落新妇苷(astilbin，图1) ，2(R):3(R)-3,4,5,7-4 羟基黄烷酮 -3-L-
11、吡喃鼠李糖苷，是一种从传统中药土茯苓(Rhizoma Smilacis Glabrae)中提取的二氢黄酮类化合物，为土茯苓的有效成分之一 1。近年研究发现，落新妇苷广泛存在于自然界多种植物中，如巴西芸香（Dimorphandramollis ），葡萄，土茯苓，菝葜，黄杞叶，贯叶连翘，草珊瑚等。落新妇苷具有很强的的抗氧化能力，能有效清除超氧阴离子和羟自由基等 2，具有抑制辅酶A还原酶，抑制醛糖还原酶，保护肝脏，镇痛，抗水肿等多种生物学活性，并且具有选择性免疫抑制作用，可以作为免疫抑制剂用于免疫相关疾病的治疗。落新妇苷易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，但其水溶性极差，25 时溶解度仅为250
12、g/mL，根据中国药典属极微溶解样品，这在一定程度上限制了落新妇苷的生物应用。硒能以多种化学形式存在于生物体内,并通过食物链影响到人体，硒是人类必需的微量元素，对人体健康有着重要作用 4，但其营养剂量和可耐受的最高剂量之间范围极窄，容易引起硒中毒。相对于无机硒和有机硒，当单质硒以纳米态存在时具有很高的生物活性和安全低毒性。纳米硒具有抗氧化性和抗癌性，可以预防和治疗多种疾5。因此，无毒且高生物活性的纳米硒作为药物、保健品等被广泛的用于生物、医药领域。为获取稳定的纳米材料,其有效方法之一是加入修饰剂。本实验选用落新妇苷为修饰剂制备纳米硒溶胶，既可以克服落新妇苷水溶性差的特点，又能克服无机硒和有机硒
13、毒性大这一缺点。通过评价落新妇苷纳米硒溶胶对羟自由基、氧自由基的清除效果，证明落新妇苷纳米硒有望成为一种高效的、稳定的新型抗氧化材料，为落新妇苷修饰纳米硒这一技术能更好地运用在食品、医疗卫生等领域提供了理论依据，也为水溶性极差的落新妇苷的生物应用开阔了新的前景。图1 落新妇苷分子结构落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用21 试验材料与方法1.1 主要试剂落新妇苷（纯度为 80%） 南京景竹生物科技有限公司亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司维生素 C 上海蓝季科技发展有限公司 邻苯三酚 天津市大茂化学试剂厂盐酸 天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠 天津市大茂化学试剂厂无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂双氧
14、水 天津市大茂化学试剂厂过硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂绿矾 天津永大化学试剂开发中心水杨酸 天津永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠 天津永大化学试剂开发中心Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化学试剂厂铁氰化钾 天津市福晨化学试剂厂三氯化铁 西陇化工股份有限公司1.2 仪器与设备超纯水机 厦门精艺兴业科技有限公司JD1000-2 电子天平 沈阳龙腾电子有限公司GPX-9248 干燥箱/培养箱（两用） 上海跃进医疗器械有限公司HH-数显恒温搅拌循环水箱 上海圣科仪器设备有限公司CL-3 型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司UV-5200PC 紫外可见分光光度计 上
15、海美析仪器有限公司YP-2 压片机 上海山岳科学仪器有限公司IS5 傅里叶红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司TGL-16GB 台式离心机 上海书培实验设备有限公司TDL-5-A 低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂SB-3200DTDN 超声波清洗机 宁波新艺生物科技服份有限公落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用3司BDC-215KS 电冰箱 青岛海尔股份有限公司1.3 主要试剂配制方式 1.3.1 落新妇苷纳米硒合成所需溶液1）60乙醇溶液：量取 60 mL 无水乙醇并加入 40 mL 的超纯水，混匀。2） 25 mM 的落新妇苷的乙醇溶液：将纯度为 80的落新妇苷粉末准确称取0.35 g，
16、溶于 60乙醇中 6，定量转入 25 mL 的容量瓶中，并定容至刻度。3）0.1 M 的 Na2SeO3 溶液：准确称取 0.17 g Na2SeO3 粉末，溶于超纯水中，转入10 mL 容量瓶中，并定容至刻度。1.3.2 清除羟自由基所需溶液1）6 mM 的绿矾（FeSO 47H2O）溶液：准确称取 0.17 g 绿矾晶体，用超纯水溶解于烧杯中，转入 100 mL 容量瓶，定容至刻度，摇匀。2）6 mM 的水杨酸溶液：准确称取 0.03 g 水杨酸，用无水乙醇溶于烧杯中，转入 100 mL 容量瓶，定容至刻度，摇匀。3）6 mM 的双氧水：准确称取 0.07 g 30H 2O2 溶液于 10
17、0 mL 容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，摇匀。1.3.3 还原力测定所需溶液1）磷酸缓冲液（0.2 mol/mL, pH=6.6）：甲液-M（磷酸氢二钠十二结合水）：称取 7.16 g 溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100mL 的容量瓶中； 乙液-M（磷酸二氢钠）：称取 2.5 g 溶于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中,取 40 mL 甲液，60 mL 乙液混合，即配制成目标液。2）铁氯化钾溶液（1%）：称取 1 g 铁氰化钾溶于烧杯中，加蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。3）三氯乙酸溶液（10）：称取 10 g 三氯乙酸溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL 的容量瓶中。
18、4）三氯化铁溶液（0.1%）：称取 0.1 g 的三氯化铁溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL 的容量瓶中。1.3.4 清除超氧阴离子所需溶液1）Tris-Hcl 溶液（50 mM，pH=8.2）：称取 0.61 g 样品于烧杯中，加入 80 mL去离子水，加浓盐酸调 pH 为 8.2，再移入 100 mL 容量瓶中定容。落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用42) 邻苯三酚溶液（25 mM）：准确称取邻苯三酚 0.32 g，用超纯水溶解于烧杯中，转入 100 mL 容量瓶，定容至刻度，摇匀。3) HCl 溶液（10 mM）：准确吸取 0.08 mL 浓度为 12 mol/L HCl 于 100
19、 mL 容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，摇匀。1.3.5 标准溶液1) 落新妇苷标准溶液：准确称取落新妇苷标准品 1 mg 溶于 1 mL 60%乙醇中，摇匀。2) Vc 溶液：准确称取 0.02 g Vc，用超纯水溶解于烧杯中，转入 100 mL 棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，低温避光保存。2 试验方法2.1 落新妇苷的纳米合成取配制好的 0.1 M Na2SeO3 溶液 0.5 mL，25 mM 落新妇苷乙醇溶液 8 mL，按顺序加入小烧杯中，以 450 r/min 转速在室温条件下用 CL-3 型恒温加热磁力搅拌器搅30 min,待溶液由无色变成稳定的砖红色胶体后，将溶胶移入离心管，在
20、 6000 r/min 的条件下离心 10 min，取出上清液，将沉淀用 60%乙醇洗涤并重新分散得到稳定的纳米硒溶胶。2.1.1 高效液相色谱法对落新妇苷纳米硒的定性和定量分析色谱条件：色谱柱：C18 Agilent Eclipse Plus；流动相：乙腈（A）-0.1%乙腈水溶液（B ）；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：40 ；进样量：10 L将 1 mL 落新妇苷标准溶液及其纳米硒溶胶用 1 mL 射器分别注入进样瓶中，用0.22 m 的滤头过滤，然后放入贮液器准备进样。当待测样品从进样器注入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后进入检测器，由记录
21、仪将检测器送出的信号记录下来得到色谱图。2.1.2 紫外可见分光光度法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将上述重新分散后的落新妇苷纳米硒溶胶，用 60%的乙醇溶液稀释成样液，采用紫外可见光光度法在 200-700 nm 的波长范围内对样液进行波谱扫描，以 60%乙醇溶液做基准线校正液，将落新妇苷醇溶液与落新妇苷纳米硒样液的紫外光谱进行对比。2.1.3 傅里叶红外光谱分析法鉴定落新妇苷纳米硒的合成落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用5将上述重新分散后的落新妇苷纳米硒溶胶再次离心 10 min 后，将所得的沉淀放入干燥箱干燥，以待备用：然后取 1-2 mg 溴化钾晶体研细均匀，置于干燥的模具中，压成透明薄片，
22、用红外色谱仪扫描以扣除背景影响；接着将落新妇苷原料和干燥后的落新妇苷纳米硒分别与溴化钾研细混匀(颗粒径小于 2 m)，压成透明薄片，在 4000-400 cm-1 范围内进行红外波谱扫描，记录红外谱图。2.2 抗氧化试验2.2.1 清除羟自由基利用H 2O2与FeSO 4混合产生OH，在体系内加入水杨酸能有效地捕捉 OH并产生有色物质，该物质在波长510 nm处有最大吸收。参照文献 7的方法，在单位体积下，将落新妇苷纳米硒溶胶配制成浓度为0、10、20、30、40、50 g/mL 的样液于 6 支试管中，依次加入 1mL 6mM FeSO4 溶液和 6 mM H2O2，静置 10 min 后加
23、入 1 mL 水杨酸，混匀静置 30 min，然后在 510 nm 处测吸光度值 Ai；其他条件不变，以 1 mL 超纯水代替水杨酸测吸光度 Aj；空白对照组以 1 mL 超纯水代替样品溶液测吸光度 A0。以落新妇苷原料、 Vc 为阳性对照，计算羟自由基的清除率 E：羟自由基清除率（%）E= （A 0-Ai+Aj）/A 0100式中：A 0 为空白对照组的平均吸光度值，A i 为试样的平均吸光度值，A j 为超纯水代替水杨酸组的平均吸光度值。以样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，将三者进行比较，得出他们之间的关系。2.2.2 清除超氧阴离子采用邻苯三酚自氧化法测定,邻苯三酚在
24、碱性条件下，能迅速自氧化产生O 2-，在320 nm处有光吸收，加入一定量的自由基消除剂可对 O2-产生不同的抑制作用,进而导致吸光值的变化。参照文献 8的方法，将落新妇苷纳米硒溶胶配制成浓度为 0、2、4、6、8、10 g/mL 的样液，备用；取 12 支相同规格的试管，依次加入 2.25 mL 的 TrisHCl（50 mmol/L pH=8.2）溶液和 1 mL 的超纯水，在 25 下水浴 20 min，之后依次加入 1 mL上述配好的待测样品，再加入 0.25 mL 25 mmol/L 的邻苯三酚溶液，混合后在 25 oC落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用6水浴中反应 6 min，6
25、min 后加入 0.5 mL HCl（10 mmol/L ）溶液终止反应。在 320 nm处测其吸光度值 Ai，在其他处理不变的情况下，以 0.25 mL 超纯水代替邻苯三酚测吸光度 Aj，以 1 mL 超纯水代替样品溶液测吸光度 A0。以落新妇苷、Vc 为阳性对照。超氧阴离子自由基的清除率 S 的计算公式为： 超氧阴离子自由基清除率（%）S=（A 0-Ai+Aj）/A 0100式中：A 0 为空白对照的平均吸光度值，A i 为试样的平均吸光度值，A j 为超纯水代替邻苯三酚组的平均吸光度值。以样品浓度为横坐标，超氧阴离子自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。2.3 还原力的测
26、定采用普鲁士兰法来评价落新妇苷纳米硒溶液的还原力。参照文献 9的方法。在单位体积下，将落新妇苷纳米硒溶液配制成浓度为0、10、20、30、40、50 g/mL 的样液置于试管中，依次加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.25 mL 和 1%的铁氰化钾溶液 1.25 mL，混匀后于 50 水浴中保温 20 min 后，快速冷却，再加入 1.0 mL 10%三氯乙酸，以 3000 r/min 的转速离心 10 min，取上清液0.5 mL，加入 0.1%的三氯化铁溶液 0.25 mL，再加 1.75 mL 超纯水，充分混匀，静置10 min，在 700 nm 处测定其吸光值 Ai，以落新妇苷
27、、Vc 作阳性对照。3 结果与分析3.1 落新妇苷的纳米合成3.1.1 高效液相色谱法对落新妇苷纳米硒的定性和定量分析在一定的色谱操作条件下，每种物质有一定的保留值，而被测物质的质量 mi 与检测产生的信号色谱峰的面积 Ai 或峰高 hi 成正比，即：mi=iAi 或 mi=“ihi式中， i、“ i 为比例常数，分别成为峰面积和峰高绝对校正因子。落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用7图 2.1 落新妇苷标准溶液色谱图图 2.2 落新妇苷纳米硒的色谱图如图 2.1 与 2.2 所示，落新妇苷标准溶液的峰面积 A0=1.11275104 mAu*s，保留时间 T0=17.845 min，落新妇苷纳
28、米硒的峰面积 A=0.0438104mAu*s，T=17.810min 。将落新妇苷纳米硒的色谱图与落新妇苷标准溶液的进行对比，发现其保留时间偏差很小，在同一操作条件下，可将其视为同种物质，由此证明落新妇苷成功修饰在纳米硒上，其浓度为 0.197 g/mL。3.1.2 紫外可见分光光度法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将落新妇苷纳米硒样液与落新妇苷醇溶液的紫外光谱进行对比，如图 3 所示。落新妇苷是一种二氢黄酮醇苷，在 291、325 nm 处各有一吸收峰 10。在其他条件相同的情况下，落新妇苷修饰纳米硒后在 291 nm 处的特征吸收峰发生位移，往长波方向移动 2 nm，即吸收峰红移。由此可以判断，落新妇苷成功修饰在纳米硒表面。
