1、湖 南 农 业 大 学全 日 制 普 通 本 科 生 毕 业 论 文三种防霉剂对食品污染根霉的抑制效果研究THE EFFECT OF THREE KINDS OF FUNGICIDES ON RHIZOPUS学生姓名：学 号：年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院：食品科学技术学院湖南长沙提交日期： 年 月 1目 录摘要1关键词11 前言22 材料与方法32.1 试验材料 32.2 主要仪器32.3 试验方法32.3.1 根霉接种物的制备32.3.2 三种防霉剂对根霉的抑菌效果 42.3.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制试验42.3.4 不同防霉剂及其浓度对根霉菌孢
2、子萌发抑制试验53 结果与分析53.1 根霉接种物的制备53.2 不同防霉剂对根霉抑菌效果的比较53.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制的影响63.4 三种防霉剂及其浓度对根霉孢子萌发抑制的影响 84 结论与讨论9参考文献 10致谢11附录111三种防霉剂对食品污染根霉的抑制效果研究摘 要：本试验研究以脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠三种食品防霉剂为抑菌剂对食品污染根霉的抑菌效果，以期筛选出对根霉抑制效果最佳的防霉剂。采用牛津杯法、琼脂稀释法、二倍稀释法进行三种防霉剂对根霉菌丝生长速率影响的试验、三种防霉剂对根霉孢子萌发影响的试验。试验结果表明，在添加浓度为 1g/L 的条件下，脱氢乙酸钠、
3、山梨酸钾、丙酸钠三种防霉剂对根霉菌丝生长抑制率分别为 87.67%、27.81% 、0%。其中脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长和孢子萌发的抑制效果最强。由此可以得出结论，脱氢乙酸钠是三种防霉剂中最适合用于抑制根霉的食品防霉剂。关键词：防霉剂；脱氢乙酸钠；山梨酸钾；丙酸钠 The Effect of Three Kinds of Fungicides On RhizopusAbstract:This experiment studied the antibacterial effect of three detergents such as sodium dehydroacetate, potassiu
4、m sorbate, and sodium propionate as the bacteriostatic agent on the food-contaminated Rhizopus in order to screen out the best antifungal agent against Rhizopus. . Oxford Cup method, agar dilution method and double dilution method were used to test the effects of three kinds of antifungal agents on
5、the growth rate of mycelia, and the effects of three kinds of antifungal agents on the germination of Rhizopus spores. The experimental results show that under the conditions of the addition of 1g/L concentration, the inhibition rates of three kinds of antifungal agents such as sodium dehydroacetate
6、, potassium sorbate, and sodium propionate are 87.67%, 27.81%, and 0%, respectively. Among them, sodium dehydroacetate had the strongest inhibitory effect on mycelia growth and spore germination. From this it can be concluded that sodium dehydroacetate is the best of the three fungicides for inhibit
7、ing Rhizopus.Key words: Fungicide；Sodium dehydroacetate；Potassium sorbate ；Sodium propionate1 前言防霉剂是指为防止霉菌滋生的一种添加剂。食品、农产品、饲料等在使用及存放期间，易遭霉菌污染，使成品变质。为了防止霉菌滋生，需在产品中加入防霉剂。食品防霉剂是食品防腐剂的一种，也属于食品添加剂。根据 GB 2760-2014，脱氢乙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为 0.5g/L，山梨酸2钾在糕点、面包中的最大添加量为 1.0g/L，丙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为2.5g/L。本试验拟以实验室分离保存的食品
8、污染菌根霉作为指示菌，分别比较不同浓度的脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠对根霉菌丝生长和孢子萌发的影响，从中选出抑制根霉生长的最佳防霉剂，为其在食品生产中的应用提供理论依据。常见的食源性致病菌种类繁多，其中包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。目前水产品中的主要防腐剂有山梨酸钾，山梨酸，二氧化氯水溶液等 1。山梨酸钾作为一种不饱和脂肪酸，可在体内参与新陈代谢，最终被分解成二氧化碳和水，而几乎没有毒性 2，目前山梨酸钾已成为一种在全球范围使用广泛的化学防腐剂 3。近年来，我国主要的防腐剂的生产不但满足国内市场，而且都重视开发国际市场，我国防腐剂的出口量在世界占有重要地位。我们可以看见：在以前，人们还认为山
9、梨酸钾价格高，因而用量少。但今年随着人们环保意识的增加和渴望绿色食品的要求，加上山梨酸钾生产技术的改进，使得生产成本大幅度下降，促成了山梨酸钾的大发展和大量使用。山梨酸钾是安全的，可作为食品、药品、饲料等领域的防腐剂，商业前景十分广泛 4。山梨酸钾具有很强的抑菌活性，如今已经是食品上常用的防腐剂 5。我国是一个人口大国，据估计，我国每年有 20%30%的食物因腐败而白白损失 6。随着食品工业的发展，延长货架寿命、防止食品腐败变质成为了食品行业中重要的问题，由此防腐剂在食品生产过程中得到广泛应用 7。未来的防霉剂研究和开发应朝着优质高效、低成本的方向发展 8。一些因含有对人体及动物有害物质、或在
10、应用中存在潜在危害的防霉剂已经或将被禁用 9。脱氢乙酸钠作为一种安全性很好的食品防霉剂，对于不同的微生物表现出不同的影响，复配使用时，抗菌效果可以互补，有协同作用 10。食品防霉剂作为食品防腐剂的一大类，将是发展热点。双乙酸钠无残留,无任何毒副作用,无致癌因素，是高效霉菌与细菌的抑制剂 11。双乙酸钠的防腐效果优于目前广泛使用的丙酸盐类、山梨酸及其盐类。而其添加量比丙酸盐低,价格也低于丙酸盐、山梨酸及其盐类,被认为是高效低价、高性价比的防腐剂 12。双乙酸钠还有极强的金属螯合作用,可抑制食品中多种酶的活性,延缓脂类氧化和蛋白质分解,起到延长食品货架期和改善风味的双重作用 13。作为一种高效的粮
11、食、饲料防霉剂和优质的畜牧水产饲料营养添加剂,双乙酸钠已经具有良好的使用效果 14,但还没有广泛应用于食品中。因此本试验采用与双乙酸钠成分相似的脱氢乙酸钠作为试验用的防霉剂。经过多年实验及应用表明,霉菌产生抗药性的问题很少发生,只要选用合适的防霉剂。生产中按照一定的配方加入合适的分量，注意防霉剂的理化特性，基本上能防治3霉菌 15。而要得到合适的防霉剂以及配方和特点，需要进行抑菌试验。首先，要判断一个防霉剂是否能防治霉菌，需要用牛津杯法做定性试验 16。牛津杯法又称管蝶法 17,是抑菌试验中常用的方法。另外，菌饼法也可以做定性试验。2 材料与方法2.1 试验材料根霉（Rhizopus stol
12、onifer）：由湖南农业大学食品科学技术学院实验室提供。孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）从北京陆桥技术股份有限公司购买。 山梨酸钾、丙酸钠以及脱氢乙酸钠分别从河南恩苗食品有限公司和青岛九泰生物科技有限公司购买，均为食品级。2.2 主要仪器SPX-250B型恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司SW-CJ-1FD 型无菌操作台 苏州净化设备有限公司CX23LEDRFS1C 型生物显微镜 奥林巴斯（广州）工业有限公司LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂XB-K-25 型血球计数板 国营上海医用光学仪器厂DGYF-200 型移液枪 北京雅安达生物技术有限公司
13、DGYF-1000 型移液枪 北京雅安达生物技术有限公司AUY220 型电子天平 日本岛津制作所2.3 试验方法2.3.1 根霉接种物的制备根霉斜面菌种的活化:取冰箱保存的根霉试管斜面划线接种于 PDA 固体培养基上，置于 30 恒温培养箱中培养 24-36 h，如此反复培养菌种 3 代，制得活化的根霉菌种。根霉菌悬液的制备:向活化的根霉试管斜面中加入适量无菌生理盐水刮取菌丝，倒入带玻璃珠的无菌三角瓶中，充分振摇打断菌丝制备菌悬液，备用。根霉菌饼的制备 取制备的根霉菌悬液 0.1 mL 涂布接种到孟加拉红固体培养基上，置于 28 恒温培养箱中培养，等到根霉菌丝长满平板表面后，采用直径 6 mm
14、 的打孔器制备菌饼，备用。根霉孢子悬液 18的制备:将制备的根霉菌悬液 0.1 mL 涂布接种到 PDA 固体培养基平板上，倒置于 28 恒温培养箱中培养 48 h，由于根霉的菌丝较长，长出的孢子4部分落到培养皿盖内。用无菌生理盐水冲落培养皿盖内附着的孢子，轻轻摇匀后，再用移液管吸取 1mL 放入无菌的 200 mL 三角瓶内，并进行逐级稀释，同时采用血球计数板对每个梯度的孢子悬液进行计数，直至获得合适稀释度的孢子悬液（孢子悬液浓度：4.010 4 CFU/mL、2.510 6 CFU/mL），备用。2.3.2. 三种防霉剂对根霉的抑菌效果试验牛津杯法：取制备的根霉孢子悬液 0.1 mL 涂布
15、接种孟加拉红培养基平板，共接种平板 12 个，各平板中央放入 1 个牛津杯，然后将平板分为 4 组，每组 3 个平行。第1 组（水）分别向牛津杯中添加 200 l 无菌生理盐水、第 2 组（山）分别向牛津杯中添加 5.0 g/L 的山梨酸钾溶液 200l、第 3 组（丙）分别向牛津杯中添加 5.0 g/L 的丙酸钠溶液 200l、第 4 组（脱）分别向牛津杯中添加 5.0 g/L 的脱氢乙酸钠溶液200l，在 28温度条件下培养 38 h 后，测定并计算各皿抑菌圈大小，比较不同防霉剂对根霉的抑菌效果。抑菌圈 19大小测定：取出培养好的试验平板，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径，以直径表示
16、抑菌圈的大小，记录并分析结果。菌饼法：取配制的孟加拉红固体培养基 3 瓶（50 mL/瓶）分别添加脱氢乙酸钠、山梨酸钾和丙酸钠，使其浓度为 1g/L，分别制备平板（各 3 个平板），随后每个平板中央接种一个根霉菌饼（6mm），菌饼长满菌丝的一面朝下，在 28条件下恒温培养38 h，采用十字交叉法用游标卡尺测量并比较各菌落直径大小、生长量和抑制率。2.3.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制试验将配制好的 13 瓶（50 mL/瓶）孟加拉红固体培养基分为 3 组，第 1 组 5 瓶分别标记为 CK、脱 1、脱 2、脱 3、脱 4，并分别添加脱氢乙酸钠 0 g、0.025 g、0.050 g、
17、0.100 g、0.200 g，即除空白对照 CK 为 0 外，其他培养基中脱氢乙酸钠浓度以二倍递增，分别为 0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L；第 2 组 4 瓶分别标记为山 1、山2、山 3、山 4，并分别添加山梨酸钾 0.050 g、0.100 g、0.200 g、0.400 g，即各培养基中山梨酸钾浓度以二倍递增，分别为 1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、8.0 g/L；第 3 组 4 瓶分别标记为丙 1、丙 2、丙 3、丙 4，并分别添加丙酸钠 0.125 g、0.250 g、0.500 g、1.000 g，即各培养基中山梨酸钾浓度以二倍递增
18、分别 2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L。随后每瓶培养基制备 3 个平板，并作相应的标记，上述每个孟加拉红平板中央接种一个根霉菌饼（6mm），菌饼长满菌丝的一面朝下，在 28条件下恒温培养，当 CK 对照组长满菌丝时，采用十字交叉法测定各个平板菌落的直径，并按以下公式计算抑制率：生长量（mm）=菌落平均直径-菌饼直径（对照菌落生长量-处理菌落生长量） 抑制率（% ）=对照菌落生长量10052.3.4 不同防霉剂及其浓度对根霉菌孢子萌发抑制试验配制含 PDA 液体培养基 9mL 的试管 45 支，分为 3 组，每组 15 支，分别添加脱氢乙酸钠（0 g/L、0.5
19、 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L）、山梨酸钾（0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、 4.0 g/L、8.0 g/L）、丙酸钠（0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L），每个浓度做三个平行试管，并做相应编号。在无菌操作台上，采用 DGYF-1000 型移液枪接种 1mL 浓度为 4.0104 CFU/mL的根霉孢子悬液，放入恒温培养箱中在 28条件下恒温培养，培养 4h 后每个小时都对对照组进行镜检观察，在对照组孢子萌发数目达到孢子总数的 90%以上时，观察并记录其他组孢子萌发数目、生长情况等。3 结果与分析3.1 根霉接种
20、物的制备根霉菌种经活化培养后生长良好，菌丝生长茂密，制备的菌饼均匀，孢子悬液也达到了要求的浓度，均能满足后期试验。如图 1 所示，采用血球计数板计数孢子数量，其孢子浓度为 4.0104 CFU/mL。图 1 血球计数板计数根霉孢子数量（放大倍数 40）Fig. 1 Hemocytometer Counts Number of Rhizopus Spores (40)3.2 不同防霉剂对根霉抑菌效果的比较比较浓度为 5 g/L 的三种防霉剂对根霉的抑菌效果，如附录中图 7 为恒温培养38h 结果，由于根霉菌丝较长、生长蔓延较快以及试验操作的原因，牛津杯法从平板正面难观察到明显的抑菌圈，但是添加脱
21、氢乙酸钠平板（脱）中菌丝生长很不均匀，牛津杯周围大部分区域没有菌丝生长；添加生理盐水平板（水）中菌丝生长均匀，牛津杯周围菌丝生长丰满；另外添加山梨酸钾平板（山）牛津杯周围菌丝较短，其厚度比添加丙酸钠平板（丙）薄。由此可见，虽然脱氢乙酸钠、山梨酸钾和丙酸钠均无法6抑制根霉菌落生长，但浓度同为 5g/L 的条件下，对根霉抑菌效果较好的防霉剂是脱氢乙酸钠。由附录中图 8 可知，将菌饼接种至含不同种类相同浓度防霉剂的孟加拉红平板中培养时，不同种类防霉剂对根霉菌丝生长的抑制效果有明显差别，导致菌落直径大小不同，含脱氢乙酸钠平板（脱）中根霉菌落直径最小为 16.36mm、含山梨酸钾平板（山）中根霉菌落直径
22、为 66.64mm、而含丙酸钠平板（丙）中根霉菌落直径几乎与平板直径相同。由此说明，在添加剂浓度都为 1.0g/L 的条件下，脱氢乙酸钠对根霉的抑制作用最强。3.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制的影响将相同直径大小（6mm）的根霉菌饼接种于不同防霉剂及浓度的孟加拉红培养基平板中恒温培养 38h 后，空白对照组平板中的根霉菌丝已经长满，此时观察各平板菌落大小，如图 4 所示，每行从左到右为添加了同种防霉剂浓度从低到高的平板，图中可知同种防霉剂浓度越高，菌丝生长受到抑制越明显，菌落直径越小。当培养基中脱氢乙酸钠浓度为 0.5 g/L 时，生长的根霉菌落直径为 29.25mm；脱氢乙酸钠浓度
23、为 1.0 g/L 时，生长的根霉菌落直径为 16.36mm，脱氢乙酸钠浓度增加至 2.0 g/L 时，菌落直径与菌饼直径相同，没有菌体生长，直径仍为 6mm；当培养基中山梨酸钾浓度为 1.0 g/L 时，生长的根霉菌落直径为 66.64mm；达到本试验最大浓度 8.0 g/L 时，根霉生长抑制，菌落直径没有增大，仍是保持 6mm 的菌饼大小；当培养基中丙酸钠浓度为 2.5 g/L 时，生长的根霉菌落直径为 90.00mm；丙酸钠浓度为 20.0 g/L 时，生长的根霉菌落直径为 18.20mm。记录所有平板中菌落的直径，按照方法 2.3.3 中的计算公式计算出菌落的生长量及抑制率，结果如图
24、5、图 6。从图中可知，随着防霉剂浓度的增加，根霉菌丝生长量下降，防霉剂抑制菌丝生长抑制率呈上升趋势。三种防霉剂浓度均为 1g/L 时，脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长的抑制率为 87.67%，有效的抑制了根霉菌丝的生长，山梨酸钾对根霉菌丝生长的抑制率只有 27.81%，抑制效果比脱氢乙酸钠弱，而丙酸钠对根霉菌丝生长的抑制率为 0%，在此浓度下，丙酸钠对根霉菌丝生长没有抑制效果。根据食品安全国家标准食品添加剂使用标准(GB2760-2014)，脱氢乙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为 0.5g/L，山梨酸钾在糕点、面包中的最大添加量为1.0g/L，丙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为 2.5g/L。为了便
25、于观察，有效地比较各防霉剂对根霉的抑制效果，本试验以 GB2760-2014 规定的各防霉剂最大添加为起始浓度，随后浓度成倍递增，设计抑菌试验观察其对根霉的抑制效果（根霉孢子悬液接种浓度为 4.0104 CFU/mL，远远大于食品中霉菌含量）。7图 2 三种防霉剂作用下根霉菌落的生长量（mm）Fig 2 growth of various Rhizopus colonies under the action of three kinds of antifungal agents(mm)由图 2 可知，三种防霉剂在最大添加量时对根霉菌丝生长的抑制效果由强到弱分别是：脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠。
26、而丙酸钠在 2.5g/L 浓度内对根霉菌丝生长的抑制率为 0%，说明丙酸钠在此浓度无法抑制根霉菌丝生长。山梨酸钾虽然有抑菌效果，对根霉菌丝生长得抑制率却只有 27.81%，比脱氢乙酸钠的抑菌效果弱了将近一倍，脱氢乙酸钠对菌丝生长的抑制率达到 72.32%，抑菌效果明显。在浓度成倍增加的条件下，脱氢乙酸钠在四倍最大添加量时抑制率达到 100%，山梨酸钾在二倍最大添加量时抑制效果提升明显，丙酸钠抑菌效果并不理想，在八倍最大添加量的条件下，脱氢乙酸钠和山梨酸钾对根霉菌丝的抑制率都达到 100%，且丙酸钠对根霉菌丝的抑制率也达到 83.85%，抑菌效果明显。根据分析以上几条可以得出脱氢乙酸钠的抑制根霉
27、菌丝生长的效果最佳，山梨酸钾也有抑制效果，丙酸钠的抑制效果不佳。8图 3 三种防霉剂对根霉菌丝生长的抑制率（%）Fig3 The inhibitory effect of three fungicides on the growth of Rhizopus mycelium(%)3.4 三种防霉剂及其浓度对根霉孢子萌发抑制的影响图 4 镜检的根霉孢子（40） 图 5 镜检的根霉孢子萌发情况（40）Fig 4 Rhizopus spore microscopy（40） Fig 5 Rhizopus spore germination （40）恒温培养 10h 后，空白对照组的根霉孢子萌发数达到 90%，此时对其他组试管中的培养液进行镜检，根据观察计数结果可知，随着防霉剂的浓度增高，根霉孢子萌发数量越少，防霉剂对根霉孢子萌发的抑制率增大。
