1、闽南师范大学毕业论文（设计）QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定毛豆中 32 种磺酰脲类除草剂残留QuEChERS - liquid chromatography - tandem mass spectrometry determination of 32 kinds of sulfonylurea herbicide residues in soybean姓 名： 学 号： 系 别： 生物科学与技术学院 专 业： 食品科学与工程 年 级： 指导教师： 年 月 日1摘要建立了基于 QuEChERS 方法的液相色谱-串联质谱同时测定毛豆中 32 种磺酰脲类除草剂残留的方法。样品采用乙腈提取
2、、无水硫酸镁及氯化钠盐析、C18 分散固相萃取净化；液相色谱以 CSH C18 色谱柱梯度洗脱分离，质谱分析采用电喷雾负离子电离、按时间表的多反应监测模式（Scheduled MRM ） ，以基质匹配校准曲线外标法进行定量。32 种农药在毛豆中 3 个添加水平（10，20，100 g/kg）的回收率为 86.0% 120.9%，相对标准偏差为 1.4% 13.9%， 32 种农药的定量限（ S/N 10）为 0.2g/kg 5.0 g/kg，方法简便、灵敏、环保，适用于甜玉米及毛豆中 32 种磺酰类除草剂残留的定性定量分析。关键词：QuEChERS ；液相色谱-串联质谱；磺酰脲类除草剂；毛豆A
3、bstractBased on QuEChERS method and liquid chromatography - tandem mass spectrometry determination of 32 kinds of sulfonylurea herbicide residues in soybean. Sample by acetonitrile extraction, anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride salting-out, C18 dispersive solid-phase extraction and puri
4、fication; Performance liquid chromatography (HPLC) with CSH C18 chromatographic column and gradient elution separation, mass spectrometry using electrospray ionization ion, according to the schedule of multiple reaction monitoring mode (Scheduled MRM), with the matrix matching method of external sta
5、ndard calibration curve quantitatively. 32 kinds of pesticides in the edamame added three levels (10,20,100 mu g/kg) of recovery is 86.0% 86.0%, relative standard deviation is 1.4% 1.4%, 32 kinds of pesticide quantitative limit (S/N of 10 or higher) of 0.2 mu g/kg 5.0 mu g/kg, the method is simple,
6、sensitive, environmental protection, suitable for sweet corn and soybean in 32 kinds of sulfonyl herbicide residues of qualitative quantitative analysis. Key words: QuEChERS ; Liquid chromatography - tandem mass spectrometry; Sulfonylurea herbicides; Edamame2目 录中英文摘要 （1） 前言 （3） 1 实验部分 （3）1.1 仪器与试剂 （
7、3）1.1.1 仪器 （3）1.1.2 试剂 （3）1.1.3 32 种农药标准溶液 （4）1.1.4 基质匹配标准溶液 （4）1.2 样品前处理 （4）1.3 色谱和质谱条件 （4）2 结果与讨论 （6）2.1LC-MS/MS 分析参数的优化 （6）2.2 提取溶剂的选择 （7）2.3 分散吸附剂的选择 （7）2.4 方法评价 （7）3 结论（10）参考文献（10）致谢（11）3前言磺酰脲类除草剂具有高效、低用量、高选择性等特点成为全球主流的除草剂品种之一，被广泛应用于防除农作物中一年生及多年生杂草，虽然其用量少、毒性低，但由于大多数属于长残效除草剂，该类除草剂可能对人类健康和环境造成毒害，
8、并对后茬作物产生药害，国内外对该类农药均制定了残留限量标准 1,2，如欧盟规定噻磺隆在鲜豆类蔬菜中的最大残留限量为 0.05mg/kg2。2013 年 12 月 19 日我国农业部发布第2032 号公告，自 2015 年 12 月 31 日起禁止氯磺隆在国内销售和使用，自 2017 年 7 月1 日起禁止甲磺隆和胺苯磺隆在国内销售和使用。磺酰脲类除草剂属非挥发性弱酸，极性强，热稳定性差 3，测定方法主要有液相色谱法（HPLC ） 4,5、液相色谱 -串联质谱法（LC-MS/MS） 6-10、毛细管电泳法 11；前处理方法有液液萃取法（LLE） 4及固相萃取法（ SPE） 5-11，SPE 使用
9、的填料有分子印迹聚合物 5,9、C18 6,10,11、石墨化碳黑 7、HLB 8。SPE 及 LLE 溶剂消耗大，需旋蒸浓缩，操作费时。近年来随着检测仪器灵敏度的不断提高，样品前处理趋于简单化，QuEChERS 前处理方法已成为农药多残留分析的首选方法 12,13，并成为分散固相萃取（d-SPE ）的“模板（ template） ”方法 13，可根据分析物的物化性质及基质的种类而选择不同的分散吸附剂，但由于常用分散吸附剂 N-丙基乙二胺（PSA）可吸附酸性农药，以 PSA 进行 d-SPE 净化的 QuEChERS 方法不适于酸性农药残留的测定 12，采用 QuEChERS 方法测定毛豆中磺
10、酰脲类农药多残留至今未见报导。本文考察了基于 QuEChERS 方法对毛豆基质的提取净化效果，建立了前处理操作简单、净化效果良好、快速灵敏的 32 种磺酰脲类除草剂多残留分析方法。1 实验部分1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器API 4000 三重四极杆质谱仪（美国 AB 公司） ，配电喷雾离子源； 1200 series 液相色谱仪（美国 Agilent 公司） ；T25 高速分散机（德国 IKA 公司） ；Milli-Q 高纯水发生器（美国 Millipore 公司） ；Sigma 3-30K 高速冷冻离心机（德国 Sigma 公司） ；XP205分析天平：感量 0.01mg（瑞士 Met
11、tler 公司） 。1.1.2 试剂4PSA 及 C18 吸附剂：40 m（美国 Agilent 公司） 。无水硫酸镁（MgSO4） 、氯化钠（NaCl ） 、乙酸铵均为分析纯（上海国药集团） ；甲醇、乙腈为色谱纯（德国 Merck 公司） ，甲酸为色谱纯（美国 Fluka 公司） 。实验用水均为高纯水（经 Milli-Q 超纯水器纯化） 。1.1.3 32 种农药标准溶液32 种农药（见表 1）标准品购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司（纯度97%） ，分别以乙腈配制浓度为 100200 g/mL 的各个农药标准溶液，再以乙腈配制浓度为 1.0 g/mL 的 32 种农药混合标准
12、溶液，-18储存。1.1.4 基质匹配标准溶液移取 6 份各 0.5 mL 空白样品提取液于 2 mL 离心管中，以弱氮气（N 2）流吹至近干，分别加入 50 g/L 的 32 种农药混合标准溶液 50、100、200、300、500 L，各补加乙腈至 500 L，再各加 10 mmol/L 乙酸铵水溶液 1.0 mL 混匀，配制成1.67、3.33、6.67、10.0、16.67 g/L 相应的基质匹配标准溶液，经 0.2 m 微孔膜过滤供 LC-MS/MS 分析, 基质匹配标准溶液现配现用。1.2 样品前处理样品前处理基于未加缓冲盐的 QuEChERS 方法：称取 10.00 g 均质试样
13、于 50 mL具塞离心管中，加入 20.0 mL 乙腈、4.0 g 无水 MgSO4、1.0 g NaCl，高速均质 1 min，于 9500 r/min 离心 5 min，取上层溶液 1.0 mL 于预先加有 50mg C18 及 150mg 无水硫酸镁的离心管（2 mL）中，涡旋 30 s，以 9500 r/min 离心 5 min，静置 20 min，取 0.5 mL 滤液至离心管中，再加 10mmol/L 乙酸铵水溶液 1.0 mL 混匀，经 0.2 m 微孔膜过滤供 LC-MS/MS 分析。1.3 色谱和质谱条件Waters XSELECTTM CSHTMC18 色谱柱（2.1 mm
14、150 mm, 3.5 m） ；柱温 30 ；进样体积 10 L。流动相 A 为 0.1%甲酸，流动相 B 为 0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脱程序：04 min，70 % A50 % A； 424 min，50 % A 10 % A；2425 min，10 % A 70 % A；2535 min，70 % A。流速为 0.2 mL/min。电喷雾离子化，负离子模式；电喷雾电压：-4500 V；雾化气流速 55 mL/min，辅助气流速 55 mL/min，气帘气流速 20 mL/min，离子源温度 500 ，仪器工作软件为Analyst 1.5，扫描方式：按时间表的多反应监测（ Schedule
15、d MRM）,其他条件见表 1。5表 1 32 种农药的质谱参数、保留时间、定量限序号 化合物 监测离子对 （ m/z） 去簇电压 （ V） 碰撞能 (eV) 保留时间 (min) 定量限（ g /kg）1 氯磺隆Chlorsulfuron356.1/138.9*358.1/138.9 -45-18-18 10.51 0.32 甲嘧磺隆Sulfometuron-methyl363.0/122.0*363.0/181.8 -62-30-21 10.03 5.03 酰嘧磺隆Amidosulfuron368.1/258.9*368.1/108.9 -40-17-28 10.88 2.04 甲磺隆Me
16、tsulfuron-methyl380.1/138.9*380.1/213.8 -47-21-15 9.70 0.65 噻磺隆Thifensulfuron-methyl386.0/138.9*386.0/219.8 -44-25-16 9.02 1.46 苯磺隆Tribenuron-methyl394.1/153.0*395.1/153.0 -42-19-19 12.38 2.07 氟酮磺隆Flucarbazone-sodium395.1/127.9*395.1/112.8 -45-18-39 12.00 1.48 丙苯磺隆Procarbazone sodium397.1/155.9*397.
17、1/112.8 -44-17-34 12.55 0.79 乙氧嘧磺隆Ethoxysulfuron397.1/258.8*397.1/153.9 -55-18-35 14.82 1.310 醚苯磺隆Triasulfuron400.0/139.0*402.0/139.0 -57-28-28 10.30 0.211 环氧嘧磺隆Oxasulfuron405.1/181.9*405.1/122.0 -52-19-39 8.62 1.012 嘧啶磺隆Flazasulfuron406.0/250.9* 406.0/179.9 -51-20-17 12.69 1.113 苄嘧磺隆Bensulfuron-met
18、hyl409.2/253.9*409.2/189.9 -51-16-20 12.49 2.014 胺苯磺隆Ethametsulfuron-methyl409.2/167.9*409.2/140.0 -52-22-43 10.84 3.015 烟嘧磺隆Nicosulfuron409.2/153.9*409.2/228.1 -55-25-20 6.70 1.416 咪唑磺隆Imazosulfuron411.1/229.8*411.1/153.8 -55-22-31 12.69 3.317 醚磺隆Cinosulfuron412.1/154.9*413.1/154.9 -50-23-23 9.58 1
19、.418 吡嘧磺隆Pyrazosulfuron-ethyl413.1/231.9*413.1/154.0 -58-23-33 14.35 2.019 氯嘧磺隆Chlorimuron-ethyl413.1/157.9*415.1/159.9 -45-20-20 14.92 3.320 氟磺隆Prosulfuron418.1/139.0*418.1/251.9 -60-28-20 14.04 1.421 环丙嘧磺隆Cyclosulfamuron420.2/238.9*420.2/264.9 -47-16-16 16.06 1.122 四咪唑磺隆Azimsulfuron423.1/213.8*423
20、.1/135.0 -58-23-43 11.41 2.523 砜嘧磺隆Rimsulfuron430.2/185.8*430.2/274.9 -63-18-22 10.55 2.524 氯吡嘧磺隆Halosulfuron-methyl433.0/251.9*435.0/253.9 -57-28-28 15.30 0.625 三氟嘧啶磺隆Trifloxysulfuron436.1/280.8*436.1/153.9 -75-24-24 11.30 2.026 甲酰胺磺隆Foramsulfuron451.1/295.9*451.1/267.9 -64-19-32 8.08 1.3627 氟嘧啶磺隆F
21、lupyrsulfuron-methyl464.1/178.9*464.1/219.9 -51-18-21 13.83 1.728 甲基氟嘧磺隆Primisulfuron-methyl467.1/225.9*467.1/176.0 -45-18-44 15.70 2.029 磺酰磺隆Sulfosulfuron469.1/288.0*469.1/154.0 -84-26-40 12.04 0.830 氟胺磺隆Triflusulfuron-methyl491.2/235.9*491.2/195.9 -59-23-41 15.34 1.031 甲磺胺磺隆Mesosulfuron-methyl502.
22、1/346.9*502.1/266.8 -54-21-34 11.27 2.532 碘甲磺隆钠盐Indosulfuron-sodium506.0/138.9*506.0/307.9 -51-29-23 13.21 0.4*：定量离子对2 结果与讨论2.1LC-MS/MS 分析参数的优化磺酰脲化合物呈酸性，pKa 在 35 之间，其酸性主要来自与磺酰基相连 N 原子上H 的电离，在液相色谱流动相中加入 0.1%甲酸，可抑制磺酰脲类化合物电离，从而改善峰形并提高分离效果，具体保留时间见表 1。质谱采用电喷雾负离子电离，32 个化合物均可获得丰度较高的M-H 、M-Na 母离子，优化的质谱参数见表
23、1。文献 4-9 采用电喷雾正离子电离，实验发现咪唑磺隆、甲基氟嘧磺隆、氟酮磺隆、丙苯磺隆、碘甲磺隆钠盐 5 个化合物采用正离子电离的响应值明显低于负离子电离。 应用Scheduled MRM 扫描方式，可确保每个色谱峰有足够的采集数据点（每个色谱峰至少15 点以上） ，保证色谱峰的良好峰型及重现性，并提高灵敏度，图 1 为按 2.2 节进行前处理的甜玉米加标样品的提取离子色谱图。图 1 样品加标 32 种磺酰脲类农药（10 g /kg ）的提取离子色谱图（峰号同表 1）72.2 提取溶剂的选择磺酰脲化合物容易发生水解，其水解机制随化合物结构的不同和 pH 值的变化而变化，中性分子易水解，阴离
24、子态分子水解较慢，酸可催化水解反应的进行3。毛豆基质加标样品（添加水平 20 g /kg）采用 1%乙酸-乙腈提取，苯磺隆、嘧啶磺隆、砜嘧磺隆的回收率为 11.5% 39.2%，甲基氟嘧磺隆的回收率为 65.1%，而采用乙腈提取，32 种磺酰脲类农药的回收率为 84.6% 108.2%， RSD 为 1.2% 13.0%，因此本文采用未加缓冲盐的乙腈提取。2.3 分散吸附剂的选择玉米基质采用 PSA 进行分散固相萃取净化，32 种磺酰脲类农药在 3 个添加水平10、20、100g /kg 的回收率为 038%，因此本文不选用 PSA 吸附剂。采用 C18 为分散吸附剂，32 种磺酰脲化合物的回
25、收率为回收率为 86.0% 120.9%，相对标准偏差为1.4% 13.9%，所以本文采用 C18 为分散吸附剂。2.4 方法评价按照本文 1.2 节前处理并配制基质匹配标准溶液，在 1.67g/L 167g/L 范围内32 种化合物在毛豆基质中的基质匹配标准溶液的浓度与对应的峰面积呈良好线性关系，相关系数为 0.99781.0000在毛豆基质中各添加 10、20、100 g/kg 的 32 种磺酰脲类农药混合标准溶液进行回收率试验，每个添加浓度重复测定 6 次，32 种农药回收率为 86.0 %120.9%，相对标准偏差为 1.4 %13.9 %（见表 2） 。以 10 g/kg 加标样品定
26、量离子对色谱信号 3 倍信噪比（S/N ）确定方法检出限为0.11.8 g/kg，以 S/N10 确定方法定量限为 0.25.0 g/kg（见表 1） ，符合国内外残留限量要求 1,2。表 2 毛豆基质的加标回收率和相对标准偏差（RSD ）化合物 添加水平（g/kg） 回收率（ %） RSD( %, n = 6)10 91.1 5.420 98.0 6.4氯磺隆100 98.9 4.710 101.3 12甲嘧磺隆20 98.5 8.28100 96.6 4.310 92.8 5.520 90.1 2.1酰嘧磺隆100 92.9 3.410 97.7 2.120 99.4 2.8甲磺隆100
27、98.1 1.610 94.5 3.820 96.2 2.1噻磺隆100 98.9 1.910 78.8 5.420 88.5 3.6苯磺隆100 96.4 5.010 80.0 4.620 91.7 5.5氟酮磺隆100 95.1 3.510 90.0 3.020 92.5 4.9丙苯磺隆100 96.2 2.610 83.6 4.120 86 1.9乙氧嘧磺隆100 89.3 2.610 97.6 5.320 101.5 2.3醚苯磺隆100 97.2 3.110 95.6 2.120 93.7 3.2环氧嘧磺隆100 91.8 1.610 87.6 4.120 90.7 4.5嘧啶磺隆1
28、00 92.0 1.810 88.8 3.620 93.6 3.1苄嘧磺隆100 97.2 3.610 90.6 9.520 95.4 7.2胺苯磺隆100 101.4 3.210 89.0 1.520 90.4 1.9烟嘧磺隆100 90.4 1.610 94.6 5.720 96.8 3.2咪唑磺隆100 90.8 1.7醚磺隆 10 95.7 3.2920 99.9 3.7100 99.2 2.910 92.6 5.320 94.3 5.0吡嘧磺隆100 98.1 2.110 87.2 3.020 97.0 3.8氯嘧磺隆L100 96.6 5.010 101.0 3.420 95.5
29、5.1氟磺隆100 94.6 4.410 911 2.320 98.2 2.1环丙嘧磺隆100 96.6 2.010 100.4 2.220 92.5 4.4四咪唑磺隆100 97.9 2.110 80.7 6.020 99.7 7.9砜嘧磺隆100 90.8 4.610 97.9 4.120 93.4 2.4氯吡嘧磺隆100 93.6 1.710 87.7 7.520 93.7 4.8三氟嘧啶磺隆100 100.5 4.610 88.7 2.520 94.9 3.0甲酰胺磺隆100 96.4 2.710 80.2 11.320 87.4 8.8氟嘧啶磺隆100 89.3 10.210 84.8 6.420 91.4 3.8甲基氟嘧磺隆100 93.9 2.610 86.3 7.520 94.4 7.7磺酰磺隆100 101.9 4.510 89.5 2.720 94.9 4.4氟胺磺隆100 96.4 3.110 86.4 6.720 91.5 3.3甲磺胺磺隆100 97.7 3.3
