1、本科生毕业论文(设计)题目： 家族遗传对 Th1/Th2 型细胞因子表达调控的影响姓 名 指导教师 二级学院 基础学院 专 业 生物技术 年 级 学 号 年 月 日 目 录中文摘要 2广州医科大学本科生毕业论文1英文摘要 3前 言 4材料与方法 6结 果 8讨 论 11结 论 22参考文献 23致 谢 25诚信声明 26家族遗传对 Th1/Th2 型细胞因子表达调控的影响摘 要目的：通过观察儿童及其家族的 Th1/Th2 细胞因子表达情况，了解家族过敏史与儿童广州医科大学本科生毕业论文2Th1/Th2 细胞偏移的关系。方法：通过一份包含基本信息，本人过敏史，家族过敏史的问卷，选取 10 个家庭
2、（共 20 人）进行抽血检查，分为有家族过敏史组和无家族过敏史组，每组各 10 人。用流式细胞术检测全血白介素 4（interleukin-4,IL-4）和 干扰素（interferon-,IFN-）的含量。结果：过敏性疾病患者的全血 IL-4 水平高于正常人，差别有显著意义（t=2.401,P0.05）;有家族过敏史组全血 IL-4 水平明显高于无家族过敏史组，差别有显著意义（t=5.770,P0.05）有家族过敏史组儿童的全血 IL-4 水平也明显高于无家族过敏史组儿童，差别有统计学意义（t=13.774,P0.01 ） 。全血 IFN- 水平在两组间比较虽有差别但无统计学意义。有家族过敏
3、史组成人全血 IFN- 水平低于儿童且有统计学意义（t=-4.110,P0.05）;无家族过敏史组成人全血 IL-4 水平高于儿童且有统计学意义（t=4.554,P0.05） 。结论：家族过敏史对儿童 Th1/Th2 的平衡存在影响，有家族过敏史儿童的全血 IL-4明显增高。IL-4 水平是 Th2 细胞功能水平的直观体现，故有家族过敏史的儿童， Th2 具有相对优势。关键词：家族过敏史，Th1 / Th2，过敏性疾病，儿童Effects of familial inheritance on regulation of Th1/Th2 cytokine expression ABSTRACTO
4、bjective:This question was answered through observing Th1/Th2 cytokine expressions of the children and 广州医科大学本科生毕业论文3their family.Method:We conducted a questionnaire survey in children, which included general condition, history of allergic disease (yes/no), familial allergic history (yes/no). 10 fam
5、ilies, a total of 20 people (children and parents of each family) were recruited for blood test. Five families had familial allergic history and five did not. Then, flow cytometry (FCM) was used to detect the content of IL-4 and IFN- in whole blood. The results were analyzed by SPSS 17.0. Measuremen
6、t data were expressed by MeanSD.Results:The level of IL-4 were increased significantly of allergic patiens compared with normal(2.401,P0.05);Have a family history of allergy group IL-4 levels were significantly higher than those without family history of allergy(t=5.770,P0.05);Children with a family
7、 history of allergies,whole blood level of IL-4 was significantly higher than children without a family history of allergies,the difference was statistically significant(t=13.774,P0.01).There were no significant differences in whole blood levels of IFN- between groups whether have a family history o
8、f allergy or not,but have a family history of allergy group IFN- levels were lower than controls.In family history of allergy group,the whole blood of IFN- levels in adult were significantly lower than children,and the difference was statistically significant（t=-4.110,P0.05 ）;On the other hand,in no
9、 family history of allergy group, the whole blood level of IL-4 in adult was significantly higher than that in children,the difference was statistically significant（t=4.554,P0.05）.Conclusion:Familial inheritance may have effects on the balance of Th1/Th2 cytokine in children. The level of IL-4 cytok
10、ine, which represents Th2 cell function in children with familial inheritance, increases significantly. In them, Th2 shows relative predominance.Key word: Allergic familial history; Th1/Th2; Allergic disease; Children前 言过敏性疾病是一种常见疾病，其临床表现有很多种，包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、变应性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由 I 型超敏反应(又名速发型超广州
11、医科大学本科生毕业论文4敏反应)引起的，由 IgE 类抗体介导，肥大细胞和嗜碱粒细胞释放的活性介质引起生理功能紊乱或组织损伤。随着全球工业化程度的不断提高，过敏性疾病在过去几十年中发病率显著上升，已经成为影响人类健康的主要疾病之一，是全球关注的公众卫生问题，世界变态反应组织公布的 30 个国家过敏性疾病流行病学调查结果显示：在这些国家的 12亿总人口中，22%（约 2.5 亿人）患有 IgE 介导的过敏性疾病，例如，过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏等。据 WHO 统计，全球约有 1.5 亿哮喘患者，其中 50%以上成人及至少 80%儿童患者均由过敏因素诱发，每年死于哮喘的患者在 18
12、 万人以上 1。2009年，陈燕等 2对广州初中生做的流行病学调查结果显示：哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎的发病率分别是 6.8%、24.7%、12.7%。在美国，从 1991 年-2003 年，4 岁以上的儿童哮喘发病率增加了 160%，每年用于治疗过敏性鼻炎的费用至少有 12 亿美元 3。在近 8 年间，美国医院的门诊和急诊用于治疗儿童特异性皮炎的费用已经接近 740 万美元 4-5。湿疹在世界儿童中的发病率为 10%-20%，成人为 1%-3%6，尤其是在发达的工业化国家，经济条件较好和居住在城市的人群中发病率有持续上升的趋势 6-7。儿童一般在 2 岁内达到食物过敏发病率的最高峰，1 岁
13、时为 6%-8%，成年时下降为 1%-2%8。过敏性疾病严重影响患者的生活和健康，尤其对于儿童的体质、性情和学习等会造成很大的不利影响，严重的全身过敏反应甚至会威胁生命，同时也给社会造成巨大的经济负担。过敏性疾病的致病因素很多，例如，饮食、气候、环境变应原接触、产前危险因素的暴露、遗传易感性等。有研究表明，过敏性疾病是多基因遗传病，一级亲属的遗传因素在过敏性疾病中起了主要作用 9。国内外报道显示，父母亲有哮喘或过敏性鼻炎的儿童患哮喘等过敏性疾病的风险明显高于父母亲无过敏性疾病的儿童。在父母双方均无过敏性疾病时，其子女患过敏性疾病的几率为 10%-20%；父母任一方患过敏性疾病时，其子女的患病几
14、率为 30%-50%；父母双方均患过敏性疾病时，子女的患病几率高达 60%-100%10。目前，家族过敏史影响儿童过敏性疾病易感性的机制尚未明确，继续深入研究是十分必要的。根据细胞因子的分泌模式，CE4 +T 细胞可分为 Th1 和 Th2 亚群，它们来自同一个前体细胞 Th0，Th1 和 Th2 是 Th0 发展出的两种极化形式。Th1 主要分泌 IL-2、IFN-、IL-12、TNF- 和 TNF-,称为 Th1 型细胞因子，并介导细胞免疫，例如，激活细胞毒性 T细胞（CTL）和巨噬细胞，介导迟发型超敏反应（DTH） ；Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10
15、和 IL-13，称为 Th2 型细胞因子，并介导体液免疫，如激活 B 细胞核嗜酸性粒细胞 11。当 Th1/Th2 平衡失调时，即某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，Liblan 称这种现象为“克隆转换” （cloned diversion）,也有人形象地称之为“Th1/Th2漂移” 。在过敏性疾病中，Th2 及其细胞因子占优势，即 Th1/Th2 异常偏向 Th2 漂移 12。而一般认为 IFN-/IL-4 的相互作用是维持 Th1/Th2 平衡的关键。IFN- 和 IL-12 等Th1 型细胞因子可以抵抗并抑制 Th2 型反应导致的过敏性疾病 13-14。IL-4 是 IgE 合成过程中最
16、重要的调节因子，能促进 T 细胞和 B 细胞增殖并诱导粘附分子表达。IL-5 可协同IL-4 刺激 B 细胞合成 IgE，诱导嗜酸性粒细胞活化、增殖、分化、移行，延长其存活期。广州医科大学本科生毕业论文5我们怀疑家族过敏史可能与 Th1/Th2 失平衡有关，因此，本研究旨在用流式细胞术探究家族遗传因素对 Th1/Th2 型细胞因子（主要是 IFN- 和 IL-4）表达调控的影响。材料与方法1.对象选择广州医科大学本科生毕业论文6选择问卷调查中 10 个家庭共 20 人（包含儿童及父亲或母亲）进行抽血检查。20 人中有 10 名成人，男 4 例，女 6 例（年龄 325 岁，体重指数 22.11
17、.8kg/） ；10 名儿童，男 5 例，女 5 例（年龄 41 岁，体重指数 16.11.8kg/） 。分两组观察，家族过敏史阴性组中有 5 个家庭共 10 人，家族过敏史阳性组中也有 5 个家庭共 10 人。阴性组成人男 2 例，女 3 例（年龄 315 岁，体重指数 21.81.9kg/） ，儿童男 2 例，女 3 例（年龄 41 岁，体重指数 161.9kg/） 。阳性组成人男 2 例，女 3 例（年龄 325 岁，体重指数 22.31.8kg/） ，儿童男 3 例，女 2 例（年龄 41 岁，体重指数16。11.7kg/） 。阳性组家长患过敏性疾病，儿童经家长口述及皮试检查，确定没有
18、过敏性疾病。阴性组的家长和儿童均为正常。阳性组中 5 名成人均患有过敏性鼻炎，其中 2 人还合并其他过敏性疾病，一人合并支气管哮喘，一人合并过敏性皮炎。2 试剂和检测方法患者分别采集静脉血 5ml，置于含肝素钠抗凝剂的绿头管中，标本需在抽血后 2 小时内处理，用流式细胞术检测全血中 IL-4 和 IFN- 的含量。2.1 主要试剂CD3、CD8 检测试剂盒及同型对照购自德国 Beckman 公司。IL-4，IFN- 细胞因子的流式细胞检测试剂盒购自美国 eBioscience 公司。2.2 主要仪器CO培养箱及离心机购自德国 Beckman 公司；流式细胞仪（Beckman coulter e
19、pics XL）2.3 实验步骤2.3.1 检测项目CD3、CD8、IFN-r、IL-42.3.2 四色法检测步骤（1）取 200l 全血于试管中，用 RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1 等体积稀释。（2）加 10l 1g/ml PMA 工作液+8l 50g/ml Ionomycin 工作液+6.8l 0.1mg/ml Monensin 工作液（或 4l 0.5mg/ml BFA 工作液） ，混匀（3）37，5%CO培养箱培养 4-6h。混匀，取 100l 已刺激全血（或 PBMC 液）加入10l CD3 和 10l CD8，室温，避光孵育 15 分钟。A: IFN-r-FITC(
20、10l)+IL-4-PE(10l)+CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l)B: IgG1-FITC(10l)+IgG1-PE(10l) +CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l)C: CD69-PE(10l)+CD3-ECD(5l)（4）每管中加入 0.5ml 新制备的固定/破膜液（固定/破膜液工作液：1 份原液+3 份专用广州医科大学本科生毕业论文7释液） ，混匀，4避光孵育 45min。（5）加 2ml 1破膜液（1破膜工作液：1 份原液（10）+9 份纯水） ，混匀，1800rpm离心 5min，弃上清。（6）重复 d 步骤一次（此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细
21、胞，以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难）（7）各管中按下表加入相应的抗体：A: IFN-r-FITC(10l)+IL-4-PE(10l)+CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l)B: IgG1-FITC(10l)+IgG1-PE(10l) +CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l)（8）4避光孵育 30min(9) 每管加 2ml 的 1破膜液洗涤 1 次，1800rpm 离心 5min,弃上清。（9）300-500l 的 1%多聚甲醛固定液重悬细胞，上机检测。3.统计学分析用 SPSS17.0 软件进行数据分析，计数资料以率表示，各组间的比较采用独立 t 检验，p0.05 具有统
22、计学意义。结 果广州医科大学本科生毕业论文81.SPSS 数据分析结果1.1 两组间比较分析有家族过敏史组的全血 IL-4 水平明显高于无家族过敏史组，差别有统计学意义（t=5.770，P0.05） 。有家族过敏史组的全血 IFN- 水平低于无家族过敏史组，但差别无统计学意义（t=0.105 ， P0.05） （见表 1、图 1）表 1 有无家族过敏史的 IFN-、IL-4 分组结果Table1有家族过敏史 无家族过敏史IFN-（% ） 16.56.4 16.99.8IL-4（%） 4.10.9 2.20.4注： N=10，P0.05，P0.05图 1 两组血中 IFN-、IL-4 分析结果1
23、.2 有家族过敏史组的成人与儿童比较有家族过敏史组中，成人全血 IFN- 水平明显低于儿童，差别有统计学意义（ t=-4.110，P0.05 ） 。全血 IL-4 水平在成人与儿童间的差别无统计学意义（t=-0.096，P0.05 ） （见表 2） 。表 2 有家族过敏史组 IFN-、IL-4 结果广州医科大学本科生毕业论文9Table2成人 儿童IFN-（% ） 11.53.1 21.54.5IL-4（%） 4.01.4 4.10.3注： N=5，P0.05，P0.051.3无家族过敏史组的成人与儿童比较无家族过敏史组中，全血IFN-水平在成人与儿童间的差别无统计学意义（t=0.781，P0
24、.05） 。成人全血IL-4水平明显比儿童高，差别有统计学意义（t=4.554，P0.05） （见表3）表 3 有家族过敏史组 IFN-、IL-4 结果Table3成人 儿童IFN-（% ） 19.512.7 14.46.4IL-4（%） 2.50.3 1.80.2注： N=5，P0.05，P0.051.4过敏性疾病患者与正常人比较过敏性疾病患者的全血IFN-水平明显低于正常人，但差别无统计学意义（ t=-1.351，P0.05 ） 。过敏性疾病患者的全血 IL-4水平高于正常人，差别有统计学意义（t=2.401，P0.05） （见表4） 。有家族过敏史组的成人全都是过敏性疾病患者，原始数据见图2。表 4 过敏性疾病患者与正常人的 IFN-、IL-4 结果Table4过敏性疾病患者 正常人IFN-（% ） 11.53.0 19.412.7IL-4（%） 4.01.4 2.50.3注： N=5，P0.05，P0.05
