1、1两种邻苯二甲酸酯物质的抗雄激素作用研究摘 要：目的 探讨邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的抗雄激素作用。方法 参照 OECD Hershberger 试验指南进行，以 6 周龄雄性去势 SD 大鼠为试验动物，随机分为 16 组（7只/组） ，分别以 DEHP 和 DBP 为受试物，DEHP 剂量分别为 35、70、150、250、500、1000 mg/kg.bw，DBP剂量分别为 70、150、250、500、750、1000 mg/kg.bw；阴性对照组和阳性对照组分别灌胃给予玉米油和3.0mg/kg.bw 氟他胺，连续 10 天。灌胃前各组均皮下注射
2、丙酸睾酮。试验结束后测定阴茎头、腹侧前列腺、精囊、肛提肌-海绵体肌、尿道球腺重量和血清中睾酮、黄体生成素水平。利用基准剂量分析软件分析雄激素依赖组织器官重量的剂量-反应关系。结果 250、500、1000 mg/kg.bw DEHP 剂量组腹侧前列腺、肛提肌-海绵体肌、尿道球腺重量低于阴性对照,差异有统计学意义（ P0.1 同时满足时接受该模型，如果多个模型被接受，根据赤池信息量准则（Akaike information criterion，AIC ）选择 AIC 最小的模型。基准反应（Benchmark response，BMR）选择 10%，拟合推算相应的 BMD 和 BMDL,即 BMD
3、10和 BMDL10。2 结果2.1 一般观察和动物体重大鼠去势后恢复良好，活动和进食正常。各组在给样品前、给样品后体重以及各组大鼠增重差异均无统计学意义（ P0.05） 。结果见表 1。表 1 DEHP 和 DBP 对大鼠体重的影响 ( ),=7Table 1 The influence of DEHP and DBP on body weight change of rats重量/(g)剂量（mg/kg.bw）给样前 给样后 增重SC TP+玉米油 261.18.0 328.514.5 67.47.2DEHP TP35 257.84.7 327.311.5 69.49.2TP70 261.
4、96.4 332.17.8 70.28.1TP150 259.19.5 333.812.3 74.75.2TP250 258.77.5 331.617.7 72.911.3TP500 256.19.9 329.422.7 73.313.9TP1000 258.712.8 324.112.5 65.45.5PC TPFT 262.411.3 328.113.4 65.75.1SC TP+玉米油 253.010.5 325.418.1 72.510.9DBP TP70 254.715.3 324.920.2 70.17.1TP150 251.25.8 322.79.1 71.55.5TP250 2
5、53.912.8 328.219.3 74.39.8TP500 250.413.3 320.419.4 70.011.6TP750 248.19.7 321.513.1 73.47.44TP1000 254.511.3 324.113.9 69.66.9PC TPFT 252.310.9 319.512.9 68.24.9注： a表示与阴性对照组相比 P0.05。2.2 雄激素依赖性组织器官的重量及比较由表 2 可见，与阴性对照相比，250、500、1000 mg/kg.bw DEHP 剂量组的大鼠腹侧前列腺、肛提肌-海绵体肌、尿道球腺重量，以及 1000mg/kg.bw DEHP 剂量组的大
6、鼠阴茎头和精囊重量降低，差异具有统计学意义（ P0.05）；与阴性对照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP 剂量组的大鼠肛提肌 -海绵体肌、尿道球腺重量，以及750、1000mg/kg.bw DBP 剂量组的大鼠腹侧前列腺和精囊重量降低，差异有统计学意义（ P0.05）。表 2 DEHP 和 DBP 对大鼠雄激素依赖性组织器官重量的影响( ),=7Table 2 The influence of DEHP and DBP on androgen-dependent tissues weights of rats剂量（mg/kg.bw） 阴茎头（mg） 腹侧前列腺 （mg） 精
7、囊（mg） 肛提肌-海绵体 肌（mg） 尿道球腺 （mg）SC TP+玉米油 75.33.7 118.427.7 344.578.7 490.178.6 36.04.2DEHP TP35 71.44.5 108.317.7 337.023.0 421.041.7 32.05.2TP70 71.42.8 117.121.8 381.344.1 451.584.6 36.49.6TP150 70.46.3 104.719.0 373.956.0 435.358.0 33.44.8TP250 70.16.2 95.714.6a 308.652.4 368.796.2a 25.62.6aTP500 6
8、9.95.1 96.913.4a 349.167.5 392.053.5a 27.65.2aTP1000 66.67.7a 82.617.5a 256.336.3a 339.784.4a 24.34.8aPC TPFT 50.83.7a 37.416.7a 126.945.5a 163.127.4a 7.32.2aSC TP+玉米油 71.62.6 109.019.1 371.663.6 294.621.2 25.34.6DBP TP70 71.63.1 107.017.4 350.782.2 295.661.6 28.45.0TP150 70.18.8 109.022.4 327.743.6
9、 272.053.5 23.03.5TP250 70.95.0 109.624.9 392.779.8 280.344.4 25.97.5TP500 66.54.9 92.88.2 331.766.3 236.535.2a 17.85.5aTP750 68.85.8 75.514.4a 260.636.4a 243.250.0a 17.67.3a TP1000 66.74.2 80.119.3a 277.444.4a 233.339.5a 18.13.4aPC TPFT 48.83.6a 36.016.0a 122.043.8a 156.826.3a 7.02.2a注： a表示与阴性对照组相比
10、 P0.05。2.3 其他脏器的脏器系数及比较由表 3 可见，与阴性对照相比，150、250、500、1000mg/kg.bw DEHP 剂量组肝脏系数，以及 500、1000mg/kg.bw DEHP 剂量组肾脏系数升高，差异有统计学意义（ P0.05） ，其中肝脏系数随剂量的增加而增加，呈正相关关系（ r=0.875， P0.05） ；与阴性对照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP 剂量组肝脏系数，以及 750、1000mg/kg.bw DBP 剂量组的肾脏系数升高，差异有统计学意义（ P0.05） ，其中肝脏系数随剂量的增加而增加，表现出正相关关系（ r=0.542，
11、P0.05） 。表 3 DEHP 和 DBP 对大鼠其他脏器的脏器系数影响( ),=7Table 3 The influence of DEHP and DBP on organ coefficient of rats剂量（mg/kg.bw） 肝脏(%) 肾脏(%) 肾上腺()5SC TP+玉米油 3.240.18 0.700.04 0.200.03DEHP TP35 3.550.34 0.700.03 0.200.02TP70 3.610.17 0.670.03 0.200.01TP150 4.250.26a 0.700.07 0.210.02TP250 4.220.31a 0.740.04
12、 0.200.03TP500 4.850.60a 0.770.04a 0.220.04TP1000 5.310.20a 0.770.05a 0.200.02PC TPFT 3.580.34 0.740.05 0.230.06SC TP+玉米油 3.410.30 0.740.06 0.250.03DBP TP70 3.410.20 0.720.04 0.230.04TP150 3.550.13 0.780.04 0.220.04TP250 3.560.24 0.760.05 0.220.04TP500 3.690.30a 0.790.02 0.260.03TP750 3.710.26a 0.81
13、0.02a 0.250.05TP1000 3.810.07a 0.810.05a 0.280.07PC TPFT 3.380.30 0.730.04 0.210.05注： a表示与阴性对照组相比 P0.05。2.4 血清 T、LH 的测定与比较血清 T、LH 测定结果显示，阴性对照组、阳性对照组与各受试物剂量组之间差异均无统计学意义。(结果略)2.5 BMDS 分析结果BMD 分析结果显示，雄激素依赖性组织器官的发育与 DEHP、DBP 均具有剂量-反应关系(P10.1)，相应的 BMD10和 BMDL10见表 4。其中，肛提肌-海绵体肌、尿道球腺对 DEHP 和DBP 的反应均最为敏感，剂量
14、-反应关系分别见图 1 至图 4。按照模型接受拟合优度检验原则，DEHP 选择基于肛提肌-海绵体肌为终点的希尔模型模型，DBP 选择基于尿道球腺为终点的希尔模型模型，两种物质的 BMDL10分别为 35.87 mg/kg.bw 和 261.78mg/kg.bw。表 4 DEHP、DBP 导致不同终点的 BMD 和 BMDL 值Table 4 DEHP, DBP result in BMD and BMDL values of different endpoints受试物 参数（重量/mg） BMD10(mg/kg.bw) BMDL10(mg/kg.bw) 拟合模型 P1值 P2值 AICDEH
15、P 阴茎头 1193.15 732.75 指数模型 0.08 0.69 216.04腹侧前列腺 309.25 211.19 指数模型 0.02 0.62 341.18精囊 947.15 324.77 幂模型 0.01 0.12 447.23肛提肌-海绵体肌 198.59 35.87 希尔模型 0.01 0.32 475.10尿道球腺 168.51 150.38 希尔模型 0.01 0.36 227.77DBP 阴茎头 1483.42 867.32 指数模型 0.04 0.79 212.62腹侧前列腺 505.38 362.82 希尔模型 0.01 0.99 366.55精囊 541.01 47
16、3.29 希尔模型 0.01 0.29 458.66肛提肌-海绵体肌 406.65 276.78 指数模型 0.03 0.76 423.82尿道球腺 384.08 261.78 希尔模型 0.01 0.42 219.956图 1 希尔模型拟合 DEHP 和肛提肌-海绵体肌重量的剂量-反应关系Figure 1Does-response curve of DEHP and levatorani-bulbocavernous muscles weight was fitted Hill model图 2 希尔模型拟合 DEHP 和尿道球腺重量的剂量-反应关系Figure 2 Does-respons
17、e curve of DEHP and Cowpers glands weight was fitted Hill model图 3 指数模型拟合 DBP 和肛提肌-海绵体肌重量的剂量-反应关系Figure 3 Does-response curve of DBP and levatorani-bulbocavernous muscles weight was fitted Exponential model图 4 希尔模型拟合 DBP 和尿道球腺重量的剂量-反应关系Figure 4 Does-response curve of DBP and Cowpers glands weight wa
18、s fitted Hill model3 讨论Hershberger 试验通过给青春期雄性大鼠去势，使大鼠体内内源性雄激素水平降到最低，减少内源性雄激素的个体差异。去势后的大鼠经过 7d 恢复后雄激素依赖性器官组织重量达到一致的基准水平，此时雄激素依赖性器官组织对雄激素的敏感性更强，当靶器官组织受到参照雄激素（TP）刺激后重量的增加会相对一致。Hershberger 试验是目前检测抗雄激素的最有效的筛检方法 10。本课题组的阳性物 FT 在 Hershberger 试验中对大鼠的雄激素依赖性器官产生了明显的抑制作用，成功建立了检测模型。Hershberger 试验指出，如果剂量组中两个或两个以
19、上的组织器官重量出现显著减少时，可以认为实验结果呈阳性，即受试物具有抗雄性作用。本研究发现 DEHP 和 DBP 可显著影响肛提肌-海绵体肌、尿道球腺、腹侧前列腺重量，说明两种物质表现出抗雄激素作用。其他研究结果提示了这两种物质抗雄激素作用的潜在机制，比如：DEHP（500mg/kg.bw）影响青春前期雄性大鼠精子的发生、分化和成熟，血清 T 水平较对照降低 11；PAEs 导致雄性成年小鼠睾丸重量减轻和生精小管的萎缩，并伴有精原细胞的凋亡 12；低剂量的 DEHP导致大鼠前列腺质量减轻，高剂量的 DEHP 暴露导致睾丸的组织生理学改变 13。但体外受体结合试验表明 DEHP 和 DBP 不能
20、直接结合雄激素受体（Androgen Receptor,AR） 14,也有研究表明 DEHP、DBP 是通过雄激素受体非依赖性机制诱导抗雄激素作用 15。由于7Hershberger 试验模型大鼠无睾丸，下丘脑-垂体-性腺轴无法通过反馈机制进行内分泌调节，因此推测 DEHP 和 DBP 可能通过干扰雄激素转运或者改变受体水平进而影响组织对雄激素的反应能力。Byung16研究表明，DEHP 的抗雄激素作用强于 DBP，本研究也说明了这一点。本研究结果显示，DEHP 在剂量达到 250mg/kg.bw 时，对模型大鼠的腹侧前列腺、肛提肌-海绵体肌、尿道球腺产生显著抑制作用，并且存在剂量-反应关系；
21、DBP 剂量达到 500mg/kg.bw 时，对模型动物的肛提肌-海绵体肌、尿道球腺产生抑制作用，剂量上升到 750mg/kg.bw 时，腹侧前列腺和精囊也产生抑制作用。从靶器官敏感度角度来看，肛提肌-海绵体肌、尿道球腺、腹侧前列腺的反应较为敏感，精囊次之，阴茎头反应最不敏感。早有研究表明肛提肌-海绵体肌的发育依赖于睾酮 17,前列腺的发育依赖于双氢睾酮 18，因此结合肛提肌-海绵体肌和前列腺两个靶器官可以用于内分泌干扰作用机制的研究。BMD 法是目前毒理学领域确定化学物毒性参考值的最新方法，较传统的化学物未观察到有害作用剂量水平（no observed effect level, NOAEL
22、）和观察到有害作用最低水平（lowest observed adverse effect level, LOAEL）更科学 19。DEHP 和 DBP 分别在250mg/kg.bw、500mg/kg.bw 剂量组表现出了抗雄性作用，即 DEHP 和 DBP 的抗雄激素作用LOAEL 值分别为 250 和 500mg/kg.bw,相应的 NOAEL 值分别为 150mg/kg.bw 和250mg/kg.bw。结合表 4 显示结果，可知 DEHP 和 DBP 的抗雄激素作用的 BMDL10分别为150.38 和 276.78mg/kg.bw，两种物质的 BMDL10通过希尔模型和指数模型拟合所得。
23、得到的 BMDL10在数值上与 NOAEL 相近，但 BMD 法充分利用了所有的剂量-反应资料并且通过BMDL10来说明数据的变异性及不确定性，因此结果更加可靠 20。另外，本实验结果显示，DEHP 剂量为 150mg/kg.bw 及以上时，大鼠肝脏器系数显著高于阴性对照，剂量为 500mg/kg.bw 及以上时，大鼠肾脏器系数也显著高于阴性对照；DBP在剂量为 500 和 750mg/kg.bw 时也分别表现为肝和肾脏器系数增加。在多项研究 21-22中也表述了相似的结论，其作用机制有待进一步研究。综上所述，本研究中 DEHP 和 DBP 单独暴露均表现出了抗雄激素作用，但对其抗雄激素作用机
24、制尚不明确。由于在环境中 DEHP 和 DBP 不可能简单的单独暴露，因此关于两者联合暴露效果的研究实际意义更大，需进一步探究它们的联合作用模式，为该类物质的风险评估和风险管理提供科学依据。参考文献1 张蕴晖,陈秉衡,训城,等. DBP, DEHP 及其代谢物 MBP, MEHP 的体内雌激素样活性分析J.环境与职业医学,2005,22(1):11-13.2 Joffe M. Are problems with male reproductive health caused by endocrine disruption J.Occup Environ Med,2001,58(4):281-2
25、87.3 赵文红,厉曙光. VitC、VitE 对 DEHP 致果蝇脂质过氧化的拮抗作用J.同济大学学报医学版,2003,24(3):179-181.4 Ilona Q, Madeleine R B, Margot V B. The dynamics of autism spectrum disorders: how neurotoxic compounds and neurotransmitters interact J Environ Res Public Health, 2013, 10(8): 3384-3408.5 罗芬兰,蔡文琴,张吉强.大鼠孕期染邻苯二甲酸二丁酯对子代神经干细胞增
26、殖分化的影响J.第三军医大学学报,2010,32(11):1188-1191.6 Howdeshell K L, Wilson V S, Furr J, et al. A mixture of five phthalate esters inhibits fetal testicular testosterone production in the Sprague-dawley rat in a cumulative, dose-additive manner J. Toxicological Sciences, 2008,105(1):153-165.7 Carbone S, Samanie
27、go YA, Cutrera R, et al. Different effects by sex on hypothalamic-pituitary axis of prepubertal offspring rats produced by in utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate ( DEHP) J. Neurotoxicology, 2012,33(1): 78-84.8 OECD. 2009a. OECD test guideline 441 Hershberger bioassay in rat
28、s: a short-term screening assay for (anti) androgenic properties. Available at:http:/www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-441-hershberger-bioassay-8in-rats_9789264076334-en. Accessed November 14, 2013.9 张文众,王伟,张晓鹏,等.大豆异黄酮对大鼠内分泌干扰作用研究J.中国食品卫生杂志,2009,21(3):228-231.10 Yamada T, Kunimatsu T, Sako H
29、, et al. Comparative evaluation of a 5-day Hershberger assay utilizing mature male rats and a pubertal male assay for detection of flutamides antiandrogenic activityJ.Toxicol Sci, 2000,53(2):289-96.11 李祥婷,蔡德培.环境内分泌干扰物对青春前期雄性大鼠性腺发育的不良影响及益肾填精方的治疗作用J.中国中西医结合杂志,2013,33(12):1690-1695.12 De Iuliis GN, Tho
30、mson LK, Mitchell LA, et al. DNA damage inhuman spermatozoa is highly correlated with the efficiency of chromatin remodeling and the formation of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, a marker of oxidative stress.BiolReprod,2009,81 (3): 517-524.13 Christiansen S, Boberg J, Axelstad M, et al. Low-dose perinata
31、l exposure to di（2-ethylhexyl）phthalate induces anti-androgenic effects in male ratsJ. Reprod Toxicol,2010,30（2）:313-321.14 Tae S K, Chang Y Y, Ki K J, et al. In vitro study of Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) endocrine disruptor screening and testing methods- establishm
32、ent of a recombinant rat androgen receptor (rrAR) binding assay. The Journal of Toxicological Sciences.2010,35(2):239-243.15 Akingbemi BT, Ge R, Klinefelter GR, et al. Phthalate-induced Leydig cell hyperplasia is associated with multiple endocrine disturbances. Proceedings of the National Academy of
33、 Sciences of the United States of AmericaJ.2004,101(3):775-780.16 Lee BM, Koo HJ. Hershberger Assay for Anti-androgenic Effects of Phthalates. Journal of Toxicology and Environmental Health A. 2007,70(15-16): 1365-1370.17 BlohmT R, Laughlin M E, Benson H D, et al. Pharmacological induction of 5 alph
34、a-reductase deficiency in the rat: Separation of testosterone-mediated and 5 alpha-dihydrotestosterone-mediated effectsJ. Endocrinology, 1986,119(3):959-966.18 EDSTAC, 1998.Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee (EDSTAC) final report. U.S. Environmental Protection Agency. 19 Ra
35、bovsky J, Fowles J, Hill MD, et al. A health risk benchmark for the neurologic effects of styrene: comparison with NOAEL/LOAEL approachJ. Risk Anal, 2001. 21(1): 117-26.20 方瑾,贾旭东.基准计量法及其在风险评估中的应用J.中国食品卫生,2011,23(1):50-53.21 陈文婕,戴红,陈敏,等.邻苯二甲酸二乙基己酯( DEHP) 对小白鼠肝脏毒性及脂质过氧化损伤J.生态毒理学报,2012,7(1):93-98.22 王秀琴,李玲,田晓梅,等.邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯联合染毒对雌性大鼠肝脏氧化应激的影响J.环境与健康杂志,2011,28(6): 505-507.
