1、紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究1摘 要CRM1 是核运输受体 importin beta 超家族中的重要成员，主要负责一些生长调节蛋白以及肿瘤抑制蛋白包括 p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB 以及 Nrf2 等的核运输。Crm1 的过表达与许多癌症比如前列腺癌、肝癌等的发生相关，因此引起人们很大的关注，多年来被认为是抗癌的重要靶点。Crm1 的过表达会不但与癌症的发生有着重要的关系，还与一些慢性疾病如皮肤炎症的发生有关系。引起皮肤损伤的外界环境因子常见的主要是紫外线，紫外线主要来源于太阳光，紫外线分为 UVA（320400nm）
2、、UVB（280320nm）和UVC（ 280nm），其中 UVA 可达皮肤表皮及真皮，使皮肤老化松弛、色素沉淀及产生日光性角化症等；UVB 可使皮肤红肿、脱皮，产生类似烧伤的症状，部分会被平流层的臭氧吸收；UVC 危害最大，但会全部被臭氧吸收。近年来随着臭氧层被破坏，紫外线对人们的生活影响越来越大。紫外线引起的严重的皮肤损伤与 ROS 的产生有关，而 Keap1-Nrf2-ARE 信号通路在细胞防御过程中起着重要的作用，在近几年对 Keap1-Nrf2-ARE 细胞防御通路的研究主要集中在研究 Nrf2 的激活剂上，机制主要是与 Keap1 上的Cys151 反应从而激活 Nrf2，使得 N
3、rf2 进入原子核内诱导二相去毒酶等的表达，从而清除 ROS，但是 Nrf2 会在 Crm1 介导下被运出核，所以研究 Crm1 调节剂来调节 Crm1 对 Nrf2 的核输出是另一种有效的激活细胞抗氧化防御通路的途径。本实验用白色豚鼠作为实验动物先建立动物 UV 辐射损伤模型，再用抗氧化活性较强的维生素 E 和维生素 C 联合使用来验证所建立的动物 UV 辐射损伤模型，最后运用动物 UV 辐射损伤模型来研究一种筛选得到的一种天然分子咖啡酸苯乙酯（CAPE ）即 CRM1 调节剂的皮肤光保护作用。关键词：CRM1；UVB 辐射损伤；Keap1-Nrf2-ARE 通路；CAPE；核转运紫外辐射损
4、伤模型建立及治疗的研究2AbstractCRM1 is an important member of the nuclear transport receptor superfamily importin beta, primarily responsible for the nuclear transport of some growth regulator proteins and tumor suppressor proteins including p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB and Nrf2, et. It ca
5、uses a great concern for the overexpression of CRM1 being associated with the occurrence of many cancers such as prostate cancer and liver cancer, et. In these years it was considered to be an important target for anti-cancer. Overexpression of CRM1 not only has a significant relationship with the o
6、ccurrence of cancer, but also has a relationship with a number of chronic diseases such as skin inflammation.The common external environmental factor that causes skin inflammation is ultraviolet. In our life the ultraviolet mainly comes from sunlight, and the ultraviolet is divided into UVA (320400n
7、m), UVB (280320nm), UVC (280nm). UVA can reach the epidermis and dermis of skin, making the skin aging, loosing, pigmentation and generate solar keratosis psychosis; UVB makes the skin redness, peeling and produce a symptoms similar as burning damage, but some of them will be absorbed by the ozone i
8、n the stratosphere; UVC is the most harmful one, but it will all be absorbed by the ozone. In recent years, with the destruction of the ozone layer, ultraviolet impact on our life more and more.Ultraviolet-induced skin damage is associated with the generation of ROS, and the Keap1-Nrf2-ARE signal pa
9、thway plays an important role in the process of cellular defense. In recent years, studies on the Keap1-Nrf2-ARE cellular defense pathway mainly focus on the Nrf2 activator. Reaction with the cys151 on Keap1 to activate Nrf2 to get into the nucleus and induce the expression of many enzymes and facto
10、rs is the mainly mechanism of Keap1-Nrf2-ARE pathway on cellular defense. However, Nrf2 will be transported out of nuclear in the CRM1-mediated nuclear export pathway, therefore finding a CRM1 inhibitor to inhibit the nuclear export of Nrf2 is another effective way to activate the cellular antioxida
11、nt pathway.In this research I firstly use white guinea pigs to establish the ultraviolet radiation damage animal model, and secondly use vitamin C UVB radiation damage; Keap1-Nrf2-ARE pathway; CAPE; Nuclear transport紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究4第一部分：文献综述1. CRM1 介导的核运输机制1.1 CRM1 介导的核输出核膜为 DNA 复制、RNA 转录及核小体的生产提供了
12、一个隔离的细胞内环境，核膜双层膜是一种参与出了细胞凋亡和增殖以外的细胞周期调节的选择性物理屏障。RNA 的核质运输、核小体、重要的转录调节剂、细胞周期抑制剂以及特异的药物靶标都通过核孔复合体 1和转运受体分子紧密调节，这些调节物质被称为核质蛋白 2（Fig 1.1） 3。核质蛋白通过识别包含在每个蛋白质内的信号序列与货物蛋白结合，这些信号使其输入到核仁 46，然后输入到细胞核（核定位信号） 7，并输出到细胞质（核出口信号） 811。所有物质运输入或运输出细胞核都要嵌入核膜横向结构，即核孔复合体（NPC）。NPC 由大约 30 个核孔蛋白组成，嵌入在核膜双层膜中，每个 NPC运输物质的能力，这取
13、决于具体的核质蛋白及其货物。小分子蛋白或盐可以自由通过 NPC，而大于 45-60kDa 的蛋白质不能自由通过 NPC，需要可溶性核质转运受体或核质蛋白的协助。其中大多数核质转运受体属于核质蛋白- 家族，每一个核质蛋白- 识别唯一的一组货物蛋白或 RNA。这种识别是通过货物蛋白上的核定位序列（NLS）和核出口序列（NES）实现的。Fig 1. CRM1 介导核输出示意图紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究5目前有三种核质转运信号已被确定，包括被输入蛋白 / 识别的碱性氨基酸NLS 序列 12、包含更为复杂的 PY-NLS 的核质蛋白-2 13和识别疏水富亮氨酸输出信号的细胞核穿梭蛋白（CRM1 ）
14、。CRM1 结合并出口蛋白质和 RNA，已被证明是唯一能够识别 NES 的转运受体14,15。CRM1 所识别的 NES 信号序列是疏水氨基酸序列，包括异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸 16。NES 的共有序列为 HX2-3HX2-3HXH，其中 H 代表一个疏水氨基酸，X 代表一个任意氨基酸，下表数字表示潜在的重复数量 16,17。此序列可存在于很多复杂的蛋白结构，例如 -螺旋的蛋白质。在细胞核中 RanGTP 表现有高浓度，人们认为 RanGTP 的浓度梯度为核出口提供所需的能量 18。NPC 中 12%-20%的核孔蛋白是由苯丙氨酸/ 甘氨酸重复结构域（FG-重复）构成 19
15、，而 CRM1 和其他输入蛋白 -家族的核质蛋白拥有HEAT 结构域（亨廷顿，延伸因子 3、蛋白质磷酸酶 2A 和酵母 PI3 激酶TOR1），可以吸引并与核孔蛋白的 FG-重复域相互作用，随着 RanGTP 浓度梯度引发的自由扩散，促进复合物移动通过 NPC 中心通道的核孔蛋白基质 2。出口复合物在细胞核中形成，这些复合物有三个部分组成：RanGTP、CRM1、出口基质或货物蛋白 20。CRM1 结合在 RanGTP 或者货物蛋白的核出口信号序列上的能力很弱，但当后两者以协同方式共同结合在 CRM1 上时，亲和力提高了500-1000 倍 21,22。CRM1-RanGTP- 货物基质复合物
16、在细胞核中形成后便通过NPC 出口到细胞质中。进入细胞质后，RanGTP 被 RanGTP 酶水解为RanGDP，出口复合物分解为各独立元件，将基质或货物蛋白释放入细胞质中。CRM1 通过 NPC 被回收进细胞核进行下一个循环。CRM1 是一个无处不在的核输出受体蛋白，对于其结合的发生，货物基质必须含有富亮氨酸的核输出信号序列，由蛋白质磷酸化、去磷酸化或突变引起的货物蛋白的三维构象变化会使 NES 暴露并与 CRM1 结合 2325，其他的蛋白质修饰，例如 SUMO 化、泛素化、乙酰化或蛋白质特有辅助因子结合也会通过暴露出口信号引发核出口 16,26,27。所以我们可以通过设计抑制 CRM1
17、与 NES 结合的化合物来对一些与核输出有关的疾病进行研究与治疗。1.2 CRM1 抑制剂的研究进展到目前为止已经有很多通过抑制 CRM1 对核输出进行抑制的化合物被分离出来。最早被分离出来的 CRM1 抑制剂是从链霉菌中分离出来的西霉素 B（Table 1.2A），它与 CRM1 的半胱氨酸残基（半胱氨酸 528）进行迈克尔加成反应，使半胱氨酸 528 烷基化，抑制 CRM1 与货物蛋白基质的 NES 结合，从而阻断核输出 46。自此之后发现的 CRM1 抑制剂绝大多数都是通过修饰半胱氨酸 52阻止 CRM1 与货物蛋白的 NES 结合来起到抑制作用的。后来人们又从黏杆菌纤维堆囊菌总分离出了
18、 Ratjadones（Table 1.2A），包括 Ratjadone 紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究6A、B、C 、D 47，其化学结构与西霉素 B 相似，同样与 CRM1 的半胱氨酸 528进行迈克尔加成，阻碍 CRM1 与货物蛋白的 NES 结合从而达到抑制作用，该化合物在抗癌和抗真菌方面有重要作用。同样有抗肿瘤作用的化合物还有LMB（来普霉素）衍生物 43等（Table 1.2B）。Daelemans 发现了 N-azolylacrylate 类似物 PKF050-638（Table 1.2A），这是一种可逆且具有高度特异性的 CRM1 抑制剂，同样类似于西霉素 B，PKF050-
19、638 干扰了反应性位点半胱氨酸以阻碍 CRM1 与 HIV-1 Rev 蛋白的 NES 结合 42,因此具有抗 HIV 的作用。同样具有抗 HIV 作用的化合物还有缬草烯酸 45（Table 1.2A）等。Table 1.2A 几种抗癌与抗 HIV 化合物的对应结构化合物 对应结构细霉素 BLeptomycin B OH OHOH来普霉素衍生物LMB derivatives OH OHRORatjadone细霉素家族的一员 OOHR3 OR1R2PKF050-638Cl NH2NNOO缬草烯酸ValtrateOOOHOO OAcTable 1.2B 在多种癌症中作用于 CRM1 介导的核输出
20、的药物靶标、肿瘤阻遏剂和细胞周期抑制剂 3蛋白质 功能 所需修饰 癌症类型 参考文献紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究7视神经母细胞瘤蛋白肿瘤阻遏剂 被细胞周期依赖性蛋白激酶磷酸化视神经母细胞瘤44APC 肿瘤阻遏剂 单基因突变导致移码或提前终止大肠癌 48p53 肿瘤阻遏剂 被 MDM2 E3 泛素连接酶泛素化大肠癌、乳腺癌49BRCA1 肿瘤阻遏剂 BRAD1 蛋白遮盖BRCA1 的 NES乳腺癌 50p21CIP1 细胞周期抑制剂HER2/neu 基因突变并被Akt 磷酸化；BCR-ABL易位并被 Akt 磷酸化；被蛋白激酶 C 磷酸化卵巢癌、乳腺癌、慢性粒细胞白血病51拓扑异构酶 I D
21、NA 拓扑、药物靶标未知 间变性星形细胞瘤、神经母细胞瘤52拓扑异构酶 II DNA 拓扑、药物靶标被酪蛋白激酶 2 磷酸化 多发性骨髓瘤53p27KIP1 细胞周期抑制剂被 hKIS 磷酸化 乳腺癌、急性髓系白血病54FOXO 肿瘤阻遏剂 被 Akt 激酶磷酸化 乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤23InI1/hSNF5 肿瘤阻遏剂 NES 内的保守疏水残基突变恶性横纹肌样瘤24BCR-ABL 癌基因，酪氨酸激酶未知 慢性粒细胞白血病55Galectin-3 细胞增殖凋亡操纵子被酪蛋白激酶 1 磷酸化 甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌56Bok 促凋亡因子 未知 乳腺癌、 57紫外
22、辐射损伤模型建立及治疗的研究8Hela 细胞N-WASP/FAK 肌动蛋白细胞骨架调节剂由 17b-雌二醇刺激其被黏着斑激酶磷酸化，神经威奥德里奇综合征、乳腺癌、卵巢癌58核仁磷酸蛋白 肿瘤阻遏剂 288 和 290 色氨酸残基突变（急性髓性白血病）；NF-kB/RelA 遮盖（乳腺癌）急性髓性白血病、乳腺癌59Hsp90 分子伴侣 未知 乳腺癌 60雌激素受体 阻断细胞周期进入 S 期PI3 激酶 乳腺癌 61Tob 细胞周期抑制剂未知 乳腺癌 62RASSF2 肿瘤阻遏剂 MAPK/ERK-2 磷酸化 甲状腺癌、鼻咽癌63Merlin 肿瘤阻遏剂 未知 神经纤维瘤64当下对已知的被 CRM
23、1 运出核的蛋白质的研究有很多，如 Table 1.2B 中所列举的一系列在癌症中被 CRM1 运输出核的蛋白质，很可能是治疗众多癌症疾病的关键因素，通过 siRNA 和 CRM1 抑制剂来降低甚至消除 CRM1 的活性将会在治疗癌症中起到重要作用。但是在这些化合物中，也发现了很多的弊端。比如说 LMB 衍生物，它具有“脱靶”的毒性 65。为了能更好的应用于临床，目前很多研究团队正在继续开发新的 CRM1 抑制剂，或者它具有低毒性可作为单剂使用，或者它可以与已知的CRM1 抑制剂共同作用，降低毒性。相信经过不懈的研究开发，新型 CRM1 很快就会应用于临床。1.3 CRM1 的货物蛋白2. K
24、eap1-Nrf2-ARE 信号通路2.1 Keap1-Nrf2-ARE 信号通路的细胞防御机制核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）属于 CNC 亮氨酸拉链转录激活因子家族，被认为是该家族中活力最强的转录调节因子 28，与抗氧化反应、抗炎反应及细胞保护作用等有关，在皮肤氧化性损伤方面有重要作用。紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究9Nrf2 是一个 CNC（CapnCollar ）型碱性亮氨酸区域拉链（bZIP）转录因子，作为一个异源二聚体通过一种小的 bZIP 蛋白 Mafs 结合于抗氧化反应原件（ARE），并激活 ARE 依赖性转录（Fig 1.2A） 29。Nrf2 包含 6 个功能域，它
25、们是物种间保守的特定 Neh1-6（Nrf2-ECH 同源 1-6）结构域（Fig 1.2B） 29，N 末端的 Neh2 结构域介导与 Nrf2 胞质阻遏剂的结合 30，Neh4 和 Neh5 是协作结合到 CREB 结合蛋白的反式激活结构域 31，Neh1 结构域含有 CNC 型 bZIP结构域，使 Nrf2 能够与小 Maf 蛋白的 ZIP 结构域形成一个异源二聚体。Fig 1.2Kelch2 样 ECH2 相关蛋白 1（Keap1）是 Nrf2 在细胞质中的结合蛋白，75kDa的富半胱氨酸 Keap1 通过结合与 Nrf2 结合对 Nrf2 进行负调节 3234。Keap1 有三个主要
26、功能域：一个 N 末端的 BTB（Broad complex，Tram-track，and Bric-a-紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究10brac）结构域，一个中央插入区域（IVR）和靠近 C 末端的一系列 Kelch 重复（Fig 1.2B）。Kelch 结构域介导与 Nrf2 的 Neh2 结构域结合 35，BTB 结构域介导与泛素 E3 连接酶支架蛋白 Cullin-3（Cul3）的联合 36。Keap1 通过与 Nrf2 结合并将将其锚定到细胞骨架肌动蛋白来阻止 Nrf2 进入细胞核 30。在无压力的生理条件下，Keap1 活动于细胞质下调 Nrf2 激活转录的能力。在氧化刺激下，
27、ARE 活化剂通过共价修饰 Keap1 使其失活，Nrf2 摆脱 Keap1 介导的抑制作用并移动到细胞核，在核内诱导 ARE 定向基因的转录（Fig 1.2A），同时，包括 MAPK、PI3K、PCK 等的一些蛋白激酶可通过直接磷酸化 Nrf2 的方式促使其与 Keap1 分离，以此激活 Nrf237。Nrf2 包含一个双向 NLS 和一个富亮氨酸的 NES，调节其穿梭于细胞核内外，同时它是 CRM1 的一个货物蛋白，会被活化的 CRM1 运出细胞核，所以通过抑制 CRM1 的活性可以使 Nrf2 在细胞核聚集 38，从而激活 ARE 的转录，以达到抗氧化损伤的作用。2.2 Nrf2 激活剂
28、的研究进展目前通过调节 Keap1-Nrf2-ARE 通路治疗氧化性损伤的化合物有茶多酚(EGCG) ，姜黄素，莱菔硫烷等（Table 1.2.1）。EGCG 是在绿茶中提取的天然产物，属于多酚类黄酮，Na 等人 66EGCG 活化后可与谷胱甘肽结合，降低细胞中的谷胱甘肽浓度一激活蛋白激酶 C 和细胞外信号调节激酶等上游激酶，是 Nrf2 磷酸化，同时部分活化的 EGCG 可直接与 Keap1 的半胱氨酸残基反应使 Nrf2 解离，激活 Nrf2-ARE 通路。姜黄素是提取于姜黄中的天然产物，是非类黄酮多酚，可以清除体内超标的 ROS、H 2O2 和 NO 等，使细胞的氧化还原处于动态平衡的状
29、态，同时 Demirovic 等人 67发现姜黄素可以对 Keap1 中的半胱氨酸 151 进行亲电修饰，使 Nrf2 脱离 Keap1 的束缚，从而激活 Nrf2-ARE 通路。莱菔硫烷也是一种天然产物，提取于十字花科植物中的硫代葡萄糖苷，Kems 等人 68发现它并不能直接吸收大于 290nm 的光，但它可以使谷胱甘肽水平下降，激活 p38 和JNK 激酶，是 Nrf2 磷酸化，同时它可以直接降解 Nrf2-Keap1 共价化合物，激活 Nrf2-ARE 通路，起到抗氧化损伤的作用。通过以上可以发现，目前主要提取一些可以激活 Nrf2-ARE 通路的天然产物进行抗氧化治疗的研究，天然产物成本一般较低，并且呈现低刺激性，比较适用于治疗皮肤氧化损伤及皮肤炎症的治疗，但天然产物的药效也普遍不尽人意。而通过对这些天然产物的研究发现抗氧化损伤的重点在于 ROS 水平的调控、Nrf2-Keap1 共价化合物的解离和细胞谷胱甘肽水平的调控，我们可以就这几点合成一些类天然产物的化合物，达到低毒甚至无毒高效的目的。Table 1.2.1 几种抗氧化天然产物的对应化学结构化合物 化学结构
