1、温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 1 - 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 作者：周思思 导师：赵志军教授 （温州大学生命与环境科学学院，浙江温州， 325027） 摘要 ： 根据自由基的假说，高代谢率应该会增加活性氧 (ROS)的产生。然而，“解偶联生存”假说认为解偶联蛋白 （ UCPs） 可以通过降低线粒体内膜的势能减少 ROS 的产生，在这种情况下，代谢速率和 ROS 的产生之间的关系将是负相关而不是正相关。在本研究中，我们研究黑线仓鼠能量摄入、氧化应激水平、抗氧化活性，以及褐色脂肪组织 (BAT)、肝脏、心脏、骨骼肌和大脑解偶联蛋白
2、的表达。将黑 线仓鼠驯化于 5和 32.5的环境，而对照组饲养在室温下 (21C)。相对于对照组，在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠能量摄入增加了 70.7%，而在 32.5C 环境中驯化的黑线仓鼠能量摄入减少 31.3%。相对于对照组，在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠的丙二醛（ MDA）水平、总抗氧化能力（ T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）在 BAT中显著降低。相对于对照组，在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠的 UCP1 在 BAT 中的表达显著上升，而在 32.5C环境中显著下降。在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠其 UCP3 在骨骼肌的表达也 大幅上升。这些结果表明，活性氧的产生和代
3、谢率之间的关系是负相关，而不是正相关。 关键词 ： 抗氧化剂；褐色脂肪组织 (BAT)；氧化应激；黑线仓鼠；温度；解偶联蛋白 Barabensis temperature oxidation resistance and uncoupling protein expression Author: Zhou Sisi Tutor: Zhao Zhijun (College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou Zhejiang, 325027) Abstract: In line with living-f
4、ree radical surmise, higher metabolic rates should subjoin reactive oxygen species (ROS) production. But, the uncoupling survival surmise assume that uncoupling proteins (UCPs) by reducing mitochondrial membrane potential to lessen the operation of ROS, in this case, the relationship between metabol
5、ic rate and ROS production will be a negative correlation between rather than positive. We barabensis into 5 C and 32.5 C environment domesticated. The control group was 21 C . Compared with the control group, the energy intake at 5 C domesticated barabensis increased by 70.7%, while the black line
6、at 32.5 C hamster domestication decreased by 31.3%. Malonadialdehyde (MDA) levels, total antioxidant capacity (T-AOC) and glutathione peroxidase (GSH-PX) activity in BAT significantly decreased in hamsters acclimated to 5C, but increased in those acclimated to 32.5C, relative to the control. Neither
7、 ROS production, nor antioxidants in skeletal musc le, 温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 2 - liver, heart or brain tissue, were affected by temperature. UCP1 expression in BAT was significantly up-regulated in hamsters acclimated to 5C, but down-regulated in those acclimated to 32.5C, relative to
8、 the control. UCP3 expression of skeletal muscle was also up-regulated significantly in hamsters acclimated to 5C. These results suggest that the metabolic rate and the generation of Active Oxygen is associated negatively related rather than being. Description is between metabolism and the relations
9、hip between the temperature. Key words: Antioxidants; Brown adipose tissue (BAT); Oxidative stress; Striped hamster; Temperature; Uncoupling proteins 一、背景介绍 21 世纪是生物的世纪，在这样的社会大环境下，对于生物体的研究也是越发的超前，学者们花大量的时间和精力去研究前人的实验以及探究发现新的结论。通过不断的研究来探索生命的现象的本质因素。 自由基理论认为细胞 的代谢过程离不开氧的存在，生物氧化的过程是细胞获得能量的过程。自由基理论把衰老与代
10、谢联系起来，并认为呼吸代谢氧化磷酸化过程中产生过多的自由基对生物体大分子物质的氧化损伤会加速衰老的进程，从而减短了寿命。其中最主要的是活性氧 （ ROS） 水平。因为高 ROS 水平会增强氧化来损伤生物大分子如蛋白质、脂质及 DNA，因此高 ROS 水平被认为是减少预期寿命的原因。 然而有关对鸟类的研究表明，有些物种的代谢率越高其寿命反而越长。此外，与保持在室温下的小鼠相比，暴露在相对低温情况下的小鼠其代谢较高并且寿命也较长。对于代谢率与 ROS 产生的关系，在一些研究中发现这两者之间是存在着明显的负相关，对其的一个可能的解释是“解偶联求生存”假说。该假说提出，解偶联蛋白降低 ROS 的产生，
11、通过降低线粒体内膜的电位来实现的。 UCPs 是线粒体膜上的转运蛋白，迄今为止，在哺乳动物体内已发现 5 种 UCPs： UCP1 主要分布在褐色脂肪组织中； UCP2 能在白色脂肪组织、骨骼肌和免疫系统等多种组织中出现； UCP3 主要存在于骨骼肌和脂肪组织里。 UCP4 和 UCP5 主要在大脑和肝脏中出现。 UCP1调节机体产热，可介导任意食物诱导的产热。 UCP2 因为具有质 子漏功能，而减少了线粒体ROS(活性氧）产物的产生。 UCP3 有较强的减少 ROS 的 产生和从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物的能力，这样可以进一步减少氧化应激等。总的来说， UCPs 能控制线粒
12、体内 ROS 生成，与氧化应激等过程也有密切联系。 “解偶联求生存”假说预测，暴露在寒冷环境下动物的组织应该会降低 ROS 的产生而解偶联蛋白的表达量会增高。但是一些研究结果并不符合解偶联生存假说，比如暴露在寒冷环温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 3 - 境下大鼠的肝脏、心脏和骨骼肌中过氧化氢 （ H2O2） 水平增加，暴露在寒冷环境下短尾田鼠的肝脏和肌肉组 织蛋白质羰基水平显著增加。 我们设计实验来测定温度对黑线仓鼠的代谢率、氧化应激、抗氧化水平和 mRNA 的表达的影响。 我们翻阅大量的资料，仔细分析之前相关实验的数据 ，以及之前实验的相关结论，考究
13、这些之间的相关性。并且参考之前实验的相关原理以及实验存在的不足之处，为我们自己的实验做好充分的准备。 先前的一个研究发现，暴露在适度寒冷或气温相对温和的环境中，对黑线仓鼠氧化应激和抗氧化水平并没有造成显著变化。当前研究的目的是测定温度对黑线仓鼠代谢率、氧化应激和抗氧化水平的影响，以及与“解偶联求生存”假说关系。 二、实验材 料 本实验所使用的黑线仓鼠来自于河北省的农田 (11513E, 3812S)，被饲养于温州大学。黑线仓鼠被单独安置在装有适量锯末的塑料笼子里 (29 15 18 cm)，定期更换干净的锯末并且清理笼子；保证黑线仓鼠有充足的食物 (北京科奥饲料有限公司的标准啮齿动物食物 )和
14、水。实验前所有动物都安置在 21 1 C 温度的环境中。 成年仓鼠 3.5 到 4.5 个月的年龄，随机分成 3 组，低温驯化组 51C (n = 9)和温暖气温驯化组 32.51C (n = 8)，对照组保存在室温下 (211C)(n = 8)，分别饲养 6 周。所有动物的体重和食物摄入量是每两天测量一次并且及时记录数据。温度处理结束后，对各个组的组织样品进行收集与保存。 三、实验方法 3.1 总能量摄入 (GEI)，消化能量摄入 (DEI)和消化率 在实验的最后两天对总能量摄入，消化能量摄入进行测定。将每个笼子中剩下的食物以及从木榍中挑出黑线仓鼠的粪便分别装好，并且将黑线仓鼠的粪便置于 6
15、0C 的烘箱中烘干并且测量记录数据。食物和粪便的总能量用氧弹量热计测定。 总能量摄入 (GEI)，消化能量摄入 (DEI)和消化率计算使用以下方程 ： 总能量摄入 (kJ/d) = 食物摄入量 (g/d) 饲料的干物质含量 (%) 食物碎屑 食物总能量含量(kJ/g)； 消化能量摄入 (kJ/d) =总能量摄入 粪便干质量 (g/d) 粪便的总能量含量 (kJ/g)； 消化率 (%) =消化能量摄入 /总能量摄入 100% 3.2 氧化应激标记物和抗氧化酶 实验材料的提取，采用断颈法取血，将黑线仓鼠处死，快速取其肩胛间的褐色脂肪组织温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达
16、的影响 - 4 - （ BAT），腿部骨骼肌、肝脏、心脏和大脑，并且将这些实验材料储在液态氮中迅速冷冻，以保证实验材料的活性。组织的处理方式：按照一定的质量配 比将组织放置到冰冷的 0.9%的氯化钠溶液中进行匀浆，然后再放到离心机中用 3000 转的转速对其进行离心， 15 分钟后取其上清液保存在适宜的环境中待后续实验分析。用 Lowry 法测定蛋白质浓度 。 使用 (南京建成生物工程研究所 )生产的试剂测定 过氧化氢（ H2O2）水平， 并通过对过氧化氢水平的测定来分析分析黑线仓鼠的氧化应激水平。过氧化氢（ 405nm）的水平表示为毫摩尔 /克蛋白质（ mmol/g protein）。 丙二
17、醛 (MDA)作为脂质过氧化反应的指标。 MDA 是脂质过氧化反应的最终产物，用硫代巴比妥酸（ TBA）在 532nm 波长进行测定，并且产生具有粉红色的产物。组织 MDA 水平表示为纳摩尔 /克蛋白质（ nmol/mg protein）。 3.3 总抗氧化能力（ T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）活性 使用 (南京建成生物工程研究所 )生产的试剂测定 T-AOC 和 GSH-活性。 在之前的大量预实验研究中证实这些试剂都适用于黑线仓鼠。黑线仓鼠机体中有许多抗氧化物质，能使 3价的 Fe 还原成 2 价的 Fe，后者可与菲啉类物质形成稳固的络和物，通过比色可测出其抗氧化能力的高
18、低。在测定过程中，将待测液按一定要求处理后用双蒸水调零 1cm 光径， 520nm测各种管吸光度。定义：在 37时，每分钟每毫克待测液，使反应体系的吸光度 (OD)值每增加 0.01 时，为一个总抗氧化能力单位。 在 GSH-PX 活性测定的基础上还原谷胱甘肽（ GSH），过氧化氢产生氧化型谷胱甘肽（ GSSG）和 H2O 反应。 GSH 与二硫化碳代 2 硝基苯甲酸（ DTNB）反应产生 2-硝基 -5-硫代苯甲酸，可以在 412nm 处被检测的黄色化合物反应。 3.4 实时 RT-qPCR 的分析 荧光定量 PCR 分析使用 Trizol 试剂（ TAKARA，中国大连）。提取褐色脂肪组织
19、、肝、心脏、骨骼肌和脑组织总 RNA，用分光光度计测定的吸光度值确定 RNA 样品浓度，然后调节到一致水平。取用调整过浓度的总 RNA 样品 2L，用 MLV 反转录酶（ TAKARA）和 oligo（ dT18）引物进行 cDNA 的合成，反应体系为 50L。用 2L 的 cDNA 样品作为模板，使用解偶联蛋白目的基因的特定引物进行 PCR 反应（ 表 1）。 温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 5 - 表 1：用基因特异性引物序列测定实时 RT-QPCR 来分析解偶联蛋白在黑线仓鼠中的表达。 Table 1. Gene-specific primer
20、sequences used for Real-time RT-QPCR analysis of uncoupling protein (UCP) expression in the striped hamster. Gene Primers (5to 3) Size (bp) UCP1 (forward) GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAA 330 UCP1 (reverse) GGCTTTCTGTTGTGGCTAT UCP2 (forward) GCTGGCGGTGGTAGGAGAT 208 UCP2 (reverse) TGAAGTGGCAAGGGAGGT UCP3 (f
21、orward) ATGGATGCCTACAGAACC 90 UCP3 (reverse) GACAATGGCGTTTCTCGT UCP4 (forward) GCCGAATAATGAACCAAC 150 UCP4 (reverse) ACCAAGGGGTCATTCTCA UCP5 (forward) TGCCTTGTTCCGAATCTA 191 UCP5 (reverse) AATCACTCCTGACACTACCC Actin (forward) AAAGACCTCTATGCCAACA 196 Actin (reverse) ACATCTGCTGGAAGGTGG 3.5 统计数据 数据都表示为
22、平均值 标准误差， 在 SPSS 13.0 统计软件进行统计分析。体重和食物摄入量的变化检测使用重复测量方差分析。采用皮尔森相关系数分析来检验 H2O2 和 MDA 水平并 T-AOC 和 GSH-Px 活性之间的关系。 P0.05， 图1A)， 并且经过六个星期的驯化后， 3个小组黑线仓鼠的体重也没有显著的差别 (d2， F2,22=0.45，P0.05； d42， F2,22=0.94， P0.05)。 3 个小组黑线仓鼠的食物摄入量在第一天的时候没有显著的差别 (d0， F2,22=0.13， P0.05，图 1B)， 但从第二天开始一直到 42 天，相对于对照组，在 5C 环境中驯化的
23、黑线仓鼠其食物摄入量明显增加，而在 32.5C 环境中驯化的黑线仓鼠则明显减少 (d2， F2,22=16.43， P0.05，图 2D)。 22263034380 6 12 18 24 30 36 42Body mass (g)0369120 6 12 18 24 30 36 42D aysFood intake(g)5 C2 1 C3 2 .5 CA Body mass (g)0369120 6 12 18 24 30 36 42Foodintake(g)B * Foodintake (g/d)Days 温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 7 - 图
24、2 温度对黑线仓鼠总能量摄入 （ GEI， A） ，粪便的总能量 （ GE）（ B） ，消化能量摄入 （ DEI， C） 和消化率 （ D） 的影响。数据平均值 SE, *P0.05)。 BAT, brown adipose tissue. Data are means SE, *P0.05). 050100150GEI(kJ/d)a b c GEI(kJ/d) 04080120DEI(kJ/d) a c 5C 21C 32.5C b DEI(kJ/d) 0102030GE offeces (kJ/d)a b c 60708090Digestibility(%) GE of feces(g/d
25、)Digestibility (%)5C 21C 32.5C A B C D * * * 温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 8 - 4.4 氧化应激 在这 3 个小组之间 ,肌肉的过氧化氢（ H2O2）的水平都比较低，然而大脑和褐色脂肪组织（ BAT）中的过氧化氢（ H2O2）水平比较高。无论是在褐色脂肪组织（ BAT） (F2,22=2.14，P0.05)还是肝脏 (F2,22=1.50， P0.05)、心脏 (F2,22=1.50， P0.05)、肌肉 (F2,22=1.09， P0.05)、大脑 (F2,22=2.60， P0.05，图 3A)，
26、温度对于过氧化氢（ H2O2）的水平的表达几乎没有影响。这 3 个小组之间，在肝脏 (F2,22=0.77， P0.05)、心脏 (F2,22=0.17， P0.05)、肌肉 (F2,22=1.50，P0.05)和大脑 (F2,22=0.67， P0.05)， 温度对于丙二醛 (MDA)的水平的表达并没有明显的差别。然而在褐色脂肪组织（ BAT）中温度对于丙二醛 (MDA)水平的表达有明显的影响；相对于对照组在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠其 BAT 中丙二醛 (MDA)的水平降低了 41.4%，而在 32.5C环境中驯化的黑线仓鼠则升高了 196.4%(F2,22=10.40， P0.05；
27、heart， F2,22=0.15， P0.05； muscle， F2,22=1.43， P0.05；brain tissue， F2,22=0.38， P0.05；图 4A)。然而在黑线仓鼠的 褐色脂肪组织（ BAT）中温度对于总抗氧化能力（ T-AOC）水平有明显影响； 相对于对照组，在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（ T-AOC）的水平降低了 46.6%，而在 32.5C 环境中驯化的黑线仓鼠则升高了 33.4%(F2,22=3.19， P=0.06)。与其他组织相比较，大脑和心脏的总抗氧化能力（ T-AOC）较低。 在黑线仓鼠的肝脏 (F2,22=0.52， P0.05)
28、、心脏 (F2,22=2.37， P0.05)和肌肉 (F2,22=0.92，P0.05，图 4B)中 谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）水平并没有受温度的影响。 图 4 温度对黑线仓鼠 T-AOC（ A） 和 GSH-Px活性 （ B） 的影响。数据平均值 S,E, * P 0.01。 Figure 4. Effect of temperature on T-AOC (A) and GSH-PX activity (B) in striped hamsters. Data are means SE, *P0.05. 0123B A T L ive r H e a r t M us c le
29、 B r a inT-AOClevels(mmol/mg)5 C 2 1 C 3 2 CP=0.06 BAT Liver Heart Muscle Brain T-AOC activity (U/ mg)A 05101520BA T L iv e r H e a rt M u s c le Bra inGSH-PXlevels(mmol/mg)* a b a BAT Liver Heart Muscle Brain GSH-PXactivity (U/ mg)B 02468BA Tu c p 1 liv e r h e a rt m u s c le b ra in -u2 b ra in -
30、u4 b ra in -u55 C 21 C 32 . 5 C温州大学本科毕业论文 温度对黑线仓鼠抗氧化能力和解偶联蛋白表达的影响 - 10 - 但是 在黑线仓鼠的褐色脂肪组织（ BAT）中温度对谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）水平有显著的影响 ；相对于对照组在 5C 环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（ T-AOC）的水平降低了 39.4%，而在 32.5C 环境中驯化的黑线仓鼠则升高了 41.8%(F2,22=4.87， P0.05，post hoc， P0.05)。与对照组和在 5C 环境中驯化 的黑线仓鼠相比，在 32.5C 环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（ T-AOC）水平大
31、概降低了 40%；但这种差距在统计学上并不是很显著 (F2,22=3.31， P=0.06)。虽然在肝脏中过氧化氢（ H2O2）、丙二醛 (MDA)、 总抗氧化能力（ T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）存在明显的相关性，但是在褐色脂肪组织（ BAT）、心脏、肌肉和大脑中并没有发现显著的相关性 (表 3)。 表 3 黑线仓鼠不同组织的 H2O2 和 MDA 水平，以及 T-AOC 和 GSH-PX 活性 的相关性 Table 3 Pearsons Correlation Coefficients of the relationship between H2O2 and MDA l
32、evels and of T-AOC and GSH-PX activity in different tissues in the striped hamster H2O2 MDA T-AOC GSH-PX BAT H2O2 1 MDA -0.11 1 T-AOC 2.16 0.40* 1 GSH-PX -2.48 0.59* 0.31 1 Liver H2O2 1 MDA 0.64* 1 T-AOC 0.55* 0.58* 1 GSH-PX 0.69* 0.41* 0.57* 1 Heart H2O2 1 MDA 0.32 1 T-AOC -0.03 -0.05 1 GSH-PX -0.07 0.04 0.09 1 SM H2O2 1 MDA 0.22 1 T-AOC -0.37 -0.36 1 GSH-PX -0.40* -0.13 0.22 1 Brain H2O2 1 MDA 0.42* 1 T-AOC 0.12 0.01 1 GSH-PX 0.19 0.01 0.44* 1 BAT，褐色脂肪组织， SM =骨骼肌。 *P0.05； *P0.01。 BAT, brown adipose tissue, SM , skeletal muscle. *P0.05; *P0.01.
