1、 1 百手起驾 整理为您 啤酒酵母生产性能的研究 生物技术专业 2004 级 刘 莉莉 摘要 ： 在生产过程中，啤酒酵母繁殖几代之后往往容易发生优良性状衰退的现象。因此必须 进行分离纯化 。本实验通过 对 实验室 保 藏的啤酒酵母菌株的 进行 分离纯化，得到 10 株 菌，通过进一步试验，对其发酵度、发酵速度、双乙酰还原能力、凝聚性、死灭温度等五项性能进行测定， 从而 筛选出发酵度高，发酵速度适中，双乙酰还原能力强，凝聚性好，死灭温度适中的 1株 优良啤酒酵母菌株。 关键词 ： 啤酒酵母；筛选；性能测定 Research About Performance Of Beer Yeast Tech
2、nology of biology Grade 2004 Liu lingli Abstract: In the procession of production, after several generations of breeding, fine traits of brewers yeast are often prone to recession. Therefore separation and purification for the beer yeast are needed. In the experiment, we did separation and purificat
3、ion of the beer yeast which is Preserved in our Laboratory and gained 10 good strains. In order to select better the strains, I did further experiment such as determinate their fermentation, the speed of fermentation, diacetyl reduction capacity, cohesion, heat death temperature and so on.Then we se
4、lected a good strain of beer yeast with high diacetyl reduction capability and cohesion, and moderate temperature heat death and Provide a good set of methods to determine the performance of beer yeast for the production of beer. Key words: Beer Yeast; Selection; Performance Measurement 1、 前言 1.1 啤酒
5、酵母的概述： 啤酒酵母属单细胞生物 ,直径 5-10UM，在 分类学上属于微生物界，真菌门，子囊菌纲，内孢霉目，内孢霉科，酵母属啤酒酵母种1。 啤酒酵母是用于酿造啤酒的酵母。多为酿酒酵母的不同品种。啤酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整2 百手起驾 整理为您 齐。无性繁殖以芽殖为主 2。能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵乳糖和蜜二糖。 1883年 E C Hansen开始分离培养酵母并将它用于酿造啤酒。丹麦 Carlsberg酿造研究所的下面酵母是有名的。其它著名的啤酒酵母有德国的 Saaz 型下面酵母，英、日等国的上面酵母 . 1.2 啤酒酵母的分类 按细胞
6、长轴与短轴的比例，可将啤酒酵母分为三组。第一组的细胞多为圆形、卵圆形或卵形（细胞长轴 /短轴 2，主要用于酒精发酵、酿造饮料酒和面包生产。第二组的细胞形状以卵形和长卵形为主，也有圆或短卵形细胞 (细胞长轴 /短轴 2)。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于啤酒、蒸馏酒和酵母生产。第三组的细胞为长圆形 (细胞长轴 /短轴 2)。这类酵母比较耐高渗透压和高浓度盐，适合于用甘蔗糖蜜为原料生产酒精 3。 根据啤酒酵母的发酵方式，将啤酒酵母分为上 面酵母和下面酵母。上面酵母在发酵过程中处于发酵液的上面，而下面发酵酵母在发酵完毕后即沉于发酵罐的底部，由此而命名。在国外所采用的酵母通常都是上面酵母，而
7、在中国国内所采用的酵母主要是下面酵母。由上面酵母发酵而成的酵母称为上面发酵啤酒，在发酵过程中，酵母随CO2浮到发酵液面上，发酵温度 15-20 。啤酒的香味突出。由下面酵母发酵而成的啤酒称为下面发酵啤酒，发酵完毕，酵母凝聚沉淀到发酵罐底部， 发酵温度 5-10 ，啤酒的香味柔和。 1.3 啤酒酵母的保藏 3 百手起驾 整理为您 啤酒酵母的保藏 是根据酵母的生理特点，对其进行低温、缺水、缺氧等处理，使其处于生长繁殖受抑制的休眠状态，从而达到保持啤酒酵母性状的目的。啤酒酵母保藏需专人负责，主要采取以下方法保藏： (1)液体石蜡保藏； (2)固体麦汁斜面保藏； (3)液氮保藏； (4)汉生罐保藏 4
8、。 1.4 啤酒酵母的主要生产性能 ： 目前，对啤酒酵母性能的研究主要有发酵度、发酵速度、凝聚性、耐高温、双乙酰还原能力等几方面的研究，其中 对双乙酰的研究尤其多。 双乙酰是啤酒发酵过程中的重要副产物之一 ,也是衡量啤酒质量的主要指标。如果在生产过程中控制不当 ,就会使双 乙酰含量超过其阈值 , 从而给啤酒带来令人不愉快的“馊饭味” , 致使啤酒风味改变。根据双乙酰的生成机理可知，通过 抑制 - 乙酰乳酸的生成 可以 抑制双乙酰的生成 ,而缬氨酸是 - 氨基氮中的一种重要成分 ,所以 - 氨基氮的含量高低直接影响双乙酰生成的多少。 通过研究，有以下几种方法可以用来降低麦芽汁中双乙酰的含量： 1
9、）从高浓度双乙酰含量的培养基中筛选分离抗双乙酰的啤酒酵母变异菌株。这样的菌株能增加对双乙酰的还原速率 ,因此 ,用它发酵的啤酒中双乙酰含量很低。2） 加速 - 乙酰乳酸的分解速度。提高发酵温度 - 乙 酰乳酸的非酶解和双乙酰的酶还原作用都与温度有关 ,温度愈高 ,反应愈快。通风搅拌发酵时通风搅拌能加速 - 乙酰乳酸的非酶分解 , 虽然同时也加速了 - 乙酰乳酸的合成 , 但总的来说对降低双乙酰的含量是有利的。 3） 降低接种麦汁的 pH值将接种麦汁的 pH值降低至 4.4左右 , 并4 百手起驾 整理为您 不影响发酵速度 , 但在低 pH值下 , 双乙酰及其前驱物质的浓度均有所降低 , 其原因
10、 : 一方面是 - 乙酰乳酸的生成量减少 ,另一方面从 - 乙酰乳酸变为双乙酰的速度加快了。通过对生产过程中生产工艺的控制可以在一定程度上降低双乙酰对啤酒风味的 影响， 然而在进行巴氏消毒是往往容易发生双乙酰的反弹。 啤酒中双乙酰含量高及反弹主要是由 - 乙酰乳酸的存在造成的 , 只要啤酒中含有 - 乙酰乳酸和溶解氧 , 就会出现双乙酰含量高及反弹现象 , 所以 , 控制啤酒中双乙酰含量及反弹主要有以下两个途径。 1） 控制酒体中 - 乙酰乳酸及双乙酰的含量 。 若在发酵前期 - 乙酰乳酸不能彻底分解 , 双乙酰还原不完全 , 发酵后期 - 乙酰乳酸的分解以及双乙酰的还原更为困难 ,酒体中将出
11、现双乙酰、 - 乙酰乳酸含量都高的现象。所以 , 在固定发酵周期的情况下 , 发酵过程中必须 严格执行发酵工艺 , 采取有效措施 , 尽量缩短繁殖期 ; 主酵期 , 控制好主酵期的降糖速度。减少酒体中双乙酰及 - 乙酰乳酸的含量 , 以达到控制减少啤酒中的双乙酰含量及反弹幅度。 2） 控制发酵后期滤酒、灌装过程中氧的溶入在有 CO2 回收设备的厂家 , 酒液转移时可采用 CO2 背压 , 这样可避免此阶段氧与酒液的直接接触。如果在灌装过程中没有采取激泡排氧措施 , 使得瓶颈空气中氧含量高 , 巴氏杀菌后 , - 乙酰乳酸就会加速分解 ,氧化脱羧形成大量的双乙酰。货架期保存后也会因 - 乙酰乳酸
12、的氧化脱羧形成较多的双乙酰。 所以 , 采 用激泡装置是去除瓶颈空气的一个有效措施 5. 1.5 啤酒酵母性能研究的意义： 5 百手起驾 整理为您 酵母是主要令啤酒发酵的成分 。在啤酒生产过程中，啤酒酵母利用发酵液中的葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖等糖类进行发酵，产生酒精、 CO2等，经过后发酵后过滤即成为我们所喝的啤酒 。经过啤酒酵母发酵而成的啤酒经常存在以下三方面的问题：首先是 非生物稳定性不好。指在啤酒的保存过程中由非微生物因素产生的浑浊沉淀可能性。最常见的啤酒非生物浑浊是所谓蛋白质浑浊。其次是风味异常。酵母、原料 生产工艺、生产过程中的微生物管理等问题菌可引起啤酒 的风味异常。主要表现为
13、口味粗涩、苦味不正、有氧化味、双乙酰味、酵母味等。再次是喷涌现象的发生。这指的是啤酒在启盖後发生的不正常窜沫现象。严重时会窜出流失多半瓶啤酒。其主要原因为原料大麦在收获时受潮感染上霉菌等。要解决以上三个问题，除了严格发酵原料的质量、生产过程中的微生物管理、生产工艺等，选择一株生产性能良好的啤酒发酵酵母更为重要。 啤酒酵母在啤酒生产过程中起着非常重要的作用。而其性能的好坏也直接关系到了啤酒风味、稳定性等的好坏。在生产过程中，啤酒酵母由于受到周围物理环境、化学环境以及微生物环境等多方面的影响，在生产性能上往往容易发生一定程度的退化，如发酵度低、双乙酰还原能力差等，这些性能的退化直接导致了啤酒的风味
14、，稳定性等的变化。因此，在啤酒生产过程中，需要定时对啤酒酵母的生产性能进行测定，从而从中筛选出生产性能优良的菌株投入到发酵生产中去，淘汰掉生产性能已经退化了的菌株。 6 百手起驾 整理为您 2.实验材料与方法 2.1实验材料 2.1.1实验菌株： 酵母泥 2.1.2实验试剂： 氢氧化钠 盐酸 无菌水 硫酸钙缓冲液：取 0.51g水合硫酸钙、 6.80g醋酸钠、 4.05g冰醋酸，溶解后定容至 1.0L6 2.1.3培养基： a.麦芽汁培养基： 取 1kg 麦芽用水浸泡 24h 后，磨成汁，稀释至浓度为 12Brix。 b.麦芽汁琼脂培养基： 稀释麦芽汁至浓度为 12Brix。按 2%的比例将琼
15、脂加进上述麦芽汁中，调整至 pH5.4,加热溶解，然后将此培养基分装试管中。高压灭菌 ， 110， 30 分钟 c.酵母菌富集培养基： 葡萄糖 5% 尿素 0.1% 硫酸铵 0.1% 磷酸二氢钾 0.25% 磷酸氢二钠 0.05% 7 水合硫酸镁 0.1% 7 水合硫酸铁 0.01% 酵母膏0.05% 孟加拉红 0.003% pH4.57 2.1.4实验器材 ： 电子天平 显微镜 高压蒸汽灭菌锅 恒温箱 无菌操作台 糖度计 离心机 震荡器 分光光度计 水浴锅 2.2实验方法 7 百手起驾 整理为您 2.2.1菌种活化和培养 取 0.5g 生产用酵母泥加入含有 150ml 无菌酵母富集培养基的2
16、50ml三角瓶中培养 11.5天后，对菌液进行稀释，在培养皿上进行平板培养，划线分离，重复此过程 23次，使菌种充分活化。从中挑选出 10支菌落形态良好的菌株。将这 10支菌分别接入含有 80ml麦芽汁培养基的 100ml三角瓶中，以备后面实验使用 8。 2.2.2 酵母菌的性能测定 2.2.2.1凝聚性的测定实验 本实验对啤酒酵母凝聚性的测定是通过离心机来完成。通过对啤酒发酵液的离心，得到啤酒酵母沉降系数，通过与参数的对照，从而对啤酒酵母凝聚性的强弱进行测定。离心就是利用离心机转子的高速旋转而产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，从而将样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 9。
17、凝聚性的测定 a.将上述选出的 10株 菌 ， 分别接入含有 300ml麦芽汁培养基的500ml三角瓶中 ,置于 25生化培养箱中培养 3 4天 ,取出摇匀 ， 然后将培养液在 2500r/min的转速下离心 5分钟 ， 分离 ， 倒 出上部清液 ， 得到沉降的酵母泥测凝聚性。 b.取 4 6g酵母泥放入盛有 30mlpH为 4.5的 CaSO4缓冲液 (内含醋酸钠和醋酸 )的离心管中 ， 摇匀 ， 在 2500r/min的转速下离心 5分钟 ， 去上清液，保留沉淀的酵母泥。 c.用 30ml硫酸钙溶液洗涤酵母 ， 在 2500r/min的转速下离心 5分钟 ，8 百手起驾 整理为您 去上清液
18、，保留底部酵母泥。 d.向 15ml标准 离心管中加入 10ml硫酸钙缓冲液 ， 加入上述酵母 1g，用手震荡 使其悬浮 ， 在 20的水溶液中保持 20 分钟。 e.用震荡器振荡 5分钟 ， 使酵母悬浮 ， 静置 10分钟，测定沉淀酵母的体积。一 般沉淀酵母体积为 1.0ml以上者为强凝聚性 ， 0.5ml以下者为凝聚性弱的菌种。 2.2.2.2 发酵度的测定 发酵度是指在生产过程中麦芽浸出物中被啤酒酵母消耗掉的部分占浸出物总量的比例。本实验通过对啤酒生产过程中糖度的变化情况来判断啤酒酵母的发酵情况。酵母菌属兼性厌氧异养型微生物，在有氧的条件下，它可以将培养基中的糖类等有机物转化成二氧化碳和
19、水。在无氧的条件下，它们可以将培养基中的糖类等有机物转变成酒精。因此，通过测定培养基中糖类的减少情况，可以从一个侧面来反映酵母菌的性能的好坏。啤酒的发酵度 W可以用 下面 公 式 来计算 10。 W= 819.0%100 P MP P 表示发酵前培养基中的糖度； M 表示经啤酒酵母发酵后培养基中的糖度， 0.819 为换算常数。 对培养基中的糖度的测定，本实验采用波美比重计来测定。即利用比重计来测定培养基的比重，通过换算，从而得到培养基中的糖的含量，这是一种粗略的测糖方法，但操作方法简便，对本实验所预期的实验效果不产生影响。 9 百手起驾 整理为您 酵母菌发酵度测定 将筛选出的 10株 酵母菌
20、培养液 ， 分别取适量接种于 10个 装有300ml的 麦芽汁 培养基 的 500ml的小三角瓶中，并做好 标记。 记下培养基最初的糖度 P。 接种后将三角瓶置于 25的恒温箱中每天摇动三角瓶数次 ， 3 4 天 , 直至不再产生泡沫为止再过滤。用糖度计测出清液剩余浓度为 M.最终发酵度 W为 8 1 9.0%1 0 0 P MP 。 2.2.2.3死灭温度的测定 微生物的死灭温度是指该微生物在某温度下 10分钟被杀死的温度。 任何 一种微生物都有其最适合的环境生长温度，温度过低或过高均不利于其生长。啤酒酵母菌对高温的抵抗力不高 ,一般在液态加热至 50 60数分钟就会失去活性。微生物的死亡温
21、度越高 ,则其耐热能力越强，生命力也越强 11。 酵母菌死灭温度测定 a.分别从上述 10株培育菌种接入装有 5ml麦汁的试管中 ， 在 25的恒温下培养 24小时。 b.分别将其 在 50、 52、 54 、 56、 58、 60下保温 10分钟 ， 立即用冷水冷至室温 ， 然后移至 25恒温箱培养。 c.每天观察试管酵母的发酵情况 ， 观察一周 ， 如在对应某温度下该管中酵母菌不繁殖 ， 则此温度即为死亡温度。 d.为了求得较精确的啤酒酵母菌的死亡温度范围 ， 在上述实验测定的间隔范围内 ， 再以间隔时间为 1用同样的方法实验 12。 2.2.2.4发酵速度的测定 10 百手起驾 整理为您
22、 发酵速度的 快慢往往影响了啤酒生产过程中双乙酰的还原程度 ，能够对啤酒的风味产生影响。在啤酒生产过程中，当糖度降到 3.5Bx以下时，啤酒酵母基本都已经沉降到发酵罐底，继而被排出发酵罐，发酵进入到后发酵过程。此后对糖度的测量则没有意义。因此本实验通过比较酵母发酵过程中糖度降到 3.5Bx时所用的时间判断该酵母发酵速度的快慢。本实验糖度的测量用波美糖度计来进行测量。其原理同 2.2.2.2。 发酵速度测定 a.取上述 10株 菌液分别接入装有 350ml麦汁 500ml的小三角瓶中 ,在 25恒温培养 24小后，置于 10生化培养箱中培 养。 b.每隔 12小时测定其外观糖度 ,当其外观糖度降
23、至 3.5Bx或以下时， 记下发酵时间（ h） ,以发酵时间来判断其发酵速度的快慢。 2.2.2.5 双乙酰还原能力的测定 通过上述四项指标的分析，从而得到 凝聚性、发酵度、死灭温度及发酵速度四项指标综合起来较理想的两株即 5号和 10号进行培养，对其双乙酰还原能力进行测定 13。 本实验中对双乙酰还原能力强弱的测定是借助于分光光度计来完成的。在比色分析中，有色物质溶液颜色的深度决定于入射光的强度、有色物质溶液的浓度及液层的厚度。当一束单色光照射溶液时，入射光强度愈强 ，溶液浓度愈大，液层厚度愈厚，溶液对光的吸收愈多，它们之间的关系，符合物质对光吸收的定量定律，即 Lambert-Bear 定律。这就是分光光度法用于物质定量分析的理论依据。本实验的测
