1、谷胱甘肽 S转移酶 mu5对肿瘤坏死因子 诱导人支气管上皮细胞氧化损伤的 调节 作用研究 【 摘要 】 目的 建立肿瘤坏死因子 （ TNF-）诱导支气管上皮 （ 16HBE） 细胞炎症模型，探讨谷胱甘肽 S 转移酶 mu5（ GSTM5）在炎症诱导的氧化应激损伤中的作用。 方法 以 TNF-（ 10 ng/mL）刺激 16HBE细胞，运用真核细胞表达载体技术，增强 GSTM5基因表达，比色法检测细胞内丙二醛（ MDA）及总抗氧化能力（ T-AOC）； MTT 法检测细胞存活率； RT-PCR 法检测 NADPH氧化酶（ NOX）家族 NOX1、 NOX2、NOX3、 NOX4、 NOX5、双重
2、氧化酶 1（ DUOX1）、 DUOX2相关基因转录水平；蛋白质印迹法检测 NOX1和 NOX2蛋白表达水平。 结果 TNF-刺激 16HBE细胞后，细胞内 MDA水平增高， T-AOC 能力减低，细胞存活率明显降低。预转染 GSTM5质粒 可有效降低 TNF-诱导的细胞内 MDA的增高（ P0.05）。 结论 增强 GSTM5表达对炎症诱发的肺上皮细胞的氧化应激损伤有保护 性调节 作用，其机制与下调 NOX1、 NOX2基因表达密切相关。 【 关键词 】 谷胱甘肽 S转移酶 mu 5；真核细胞表达载体；氧化应激；炎症 急性肺损伤（ ALI）的本质是肺内过度失控的炎症反应 1-2。过度炎症反应
3、引发氧化应激状态 3，诱导细胞内源性活性氧（ ROS）的生成量剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力时，使机体处 于氧化应激状态，直接导致肺结构细胞损伤 4-5，并且与炎症损伤协同加重病情 6。因此，下调炎症激活的过度氧化应激可能有助于减轻肺结构细胞的损伤。谷胱甘肽 S 转移酶（ glutathione-S-transferase， GST）是一组具有多种功能的催化氧化还原反应的酶，与其他抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作用7。谷胱甘肽 S 转移酶 mu 5（ GSTM5）是 GST 家族的成员，关于 GSTM5 在 ALI 时炎症诱发的氧化应激过程中的作用研究不多。本研
4、究以代表性的炎症因子肿瘤坏死因子 （ TNF-）刺激人支气管上皮细胞，在细胞上模拟 ALI 时的炎症过程，并观察其氧化应激程度的变化；同时，利用真核细胞表达载体 技术增强表达人支气管上皮 16HBE细胞的 GSTM5 基因，探讨该基因在 TNF-诱导的人支气管上皮细胞氧化损伤中的作用及可能的机制，为 ALI 综合治疗提供实验依据。 材料与方法 一、材料 16HBE细胞由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清购于广州博仁生物科技有限公司；RPMI-1640 培养基、胰酶购于 Hyclone 公司；重组人 TNF-购自美国 Pepro Tech 公司； GSTM5-GV230-GFP质粒
5、由 上海吉凯基因技术有限公司构建 ；转染试剂 Lipofectamine2000TM购自 Invitrogen 公司；总抗氧化能力（ T-AOC）活性检测试剂盒及脂质氧化丙二醛（ MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所； BCA法蛋白浓度测定试剂盒、 MTT 试剂盒购自江苏碧云天公司；逆转录试剂购自 TaKaRa 公司； PCR 试剂购自北京康为世纪公司；引物由上海英潍捷基公司合成； NADPH氧化酶（ NOX）家族 NOX1 和 NOX2 抗体购自美国 abcam 公司； -actin 抗体购自武汉博士德公司。 二、方法 1细胞培养： 16HBE细胞在含 10%灭活胎牛血清的 RPMI
6、-1640 培养基中，置于 37 、 5% CO2、饱和湿度条 件下的培养箱中培养， 23 d 传代 1 次，取处于对数生长期的细胞用于实验。 2模型构建及实验分组：将细胞以 2105个 /mL接种于 6 孔板，待贴壁细胞融合度达到 70%更换为含GSTM5-GV230-GFP 质粒脂质体（ 1 g/mL）的无血清、无抗生素培养基培养 6 h 后，更换为完全培养基，待细胞状态恢复良好后更换为含 TNF-（ 10 ng/mL）的无血清、无抗生素培养基继续培养， 24 h 后收取培养细胞标本备检。实验分为 4 组：空白对照组（不加干预因素）， TNF-组（仅用 TNF-刺激）， GSTM5质粒组（
7、预转染 GSTM5-GV230-GFP 质粒且用 TNF-刺激），阴性对照组（预转染空质粒且用 TNF-刺激）。 3分光光度法检测细胞脂质氧化程度（ MDA 含量）：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞， BCA 法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于 532 nm 测定各样本吸光度， 测得各样本的 MDA含量后 ，除以样本的总蛋白含量，即 “nmol/mg pro”来表示 MDA水平。 4分光光度法检测细胞 T-AOC：采用玻璃匀浆器匀浆裂解细胞， BCA法定量蛋白浓度，按试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于 520 nm 测定各样本吸光 度，测得各个样本 T-AOC 后，再除以样本的总蛋
8、白含量，即 “U/mg pro”来表示 T-AOC 水平。 5 MTT 比色法检测细胞存活率：将细胞以 1104个 /mL接种于 96 孔板，按上述分组进行转染和 TNF-干预后继续培养 24 h，终止培养前 4 h 每孔加入 10 L MTT溶液（ 5 mg/mL），终止培养时加入 100 L Formazan 溶解液，待紫色结晶完全溶解，酶标仪测定各孔吸光度（ A） 值（ 570 nm）。细胞存活率 =实验组 /对照组 100%。 6 RT-PCR 法检测 NOX1、 NOX2、 NOX3、 NOX4、 NOX5、双重氧化酶 1（ DUOX1）、 DUOX2 mRNA的表达水平： Triz
9、ol法裂解各组细胞并提取细胞总 RNA，分光光度计检测 RNA 浓度及纯度，逆转录反应体系（ 20 L）： 5酶混合物 4 L， RNA 1 g， RNAase Freed H2O 补足至总体系 20 L。逆转录条件： 37 ，15 min； 85 ， 5 s。 PCR 反应体系（ 25 L）： 2含染料酶混合物 12.5 L， NOX1、 NOX2、 NOX3、 NOX4、NOX5、 DUOX1、 DUOX2 及 -actin 上下游引物各 0.5 L（ 共 1.0 L），逆转录产物模板 2 L，超纯水 9.5 L。 PCR 反应条件： 94 5 min， 94 30 s、 * 30 s、
10、72 30 s（循环 35 轮），末次 72 延伸 10 min。取 5 L产物进行 1.0%琼脂糖电泳，应用凝胶成像系统拍照。采用 Gel-Pro analyzer 32 软件分析电泳条带灰度值，计算目的基因与 -actin 的比值以表示目的基因 mRNA的相对表达量。相关引物序列见表 1。 表 1 引物序列及退火温度 引物名称 引物序列 产物大小（ bp） 退火温度（ ） NOX1 5-CTGGGTGGTTAACCACTGGTTT-3 553 52 5-ACCAATGCCGTGAATCCCTAAG-3 NOX2 5-CTGGGGTTGAACGTCTTCCTCTT-3 508 62 5-AT
11、ATGAGGCACAGCGTGATGACA-3 NOX3 5- GAGAGACTGTCTTGGGTTGG-3 683 55 5- ACTCCTCCTCTTCATACCAGTAG-3 NOX4 5-CAGGAGGGCTGCTGAAGTATCAA-3 303 57 5- TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA-3 NOX5 5-CAATGAGAAAGAGTCAAAGGTCGT-3 156 60 5- CGATGCCTGCCCCGAT -3 DUOX1 5- GCAGGACATCAACCCTGCACTCTC-3 672 65 5- CTGCCATCTACCACACGGATCTGC-3 DUO
12、X2 5- CCGGCAATCATCTATGGAG-3 5- CCGGCAATCATCTATGGAG-3 546 55 -actin 5-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3 457 51 5-GTCTTTACGGATGTCAACG-3 7蛋白质印迹法（ Western blot）检测 NOX1、 NOX2 蛋白的表达水平：分别提取各组细胞总蛋白，BCA 法蛋白定量后，每份样品取 50 g蛋白与 5SDS 上样缓冲液充分混匀，经 95 5 min 变性后进行10% SDS-PAGE电泳，转膜， 5%脱脂奶粉 37 封闭 1 h，以 TBST 洗膜 3 次， 10 min/次，分别取一抗（抗
13、体稀释浓 度： NOX1 抗体 1 100， NOX2 抗体 1 1 000，胞浆蛋白内参 -actin 抗体 1 400） 4 孵育过夜，以 TBST 洗膜 3 次， 10 min/次，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗（ 1 2 000） 37 孵育 1 h，以 TBST洗膜 3 次， 10 min/次， ECL发光， MINICHEMI 化学发光仪曝光。采用 Gel-Pro analyzer 32 软件进行图像灰度分析，分别计算 NOX1、 NOX2 蛋白与 -actin 的灰度比值，以表示 NOX1、 NOX2 蛋白的相对表达量。 三、统计学处理 应用 SPSS 13.0 软件进 行统计学分
14、析，计量资料以 x s表示。数据均进行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析（ One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用 LSD 检验法，方差不齐时多重比较采用 Dunnetts T3检验法， P0.05）。 GSTM5 质粒组 MDA水平较 TNF- 组和阴性对照组显著下调 （ 1.530.17） nmol/mg pro 比（ 1.970.26） nmol/mg pro 和（ 2.080 .07） nmol/mg pro， P0.05）。 GSTM5 质粒组 T-AOC 较 TNF- 组和阴性对照组显著上调（ 3.780.42） U/mg pro 比（ 1.300.14） U
15、/mg pro 和（ 1.280 .21） U/mg pro， P0.05）。 GSTM5 质粒组细胞存活率较 TNF- 组、阴性对照组显著升高（ 69.15%9.23%比 56.31%4.33%和 56.1%5.22%， P0.05）。TNF-组 16HBE细胞 NOX3、 NOX4、 NOX5、 DUOX1、 DUOX2 mRNA表达水平 与空白对照组比较，差异无统计学意义（ P0.05）， GSTM5 质粒组 16HBE细胞 NOX3， NOX4、 NOX5、 DUOX1、 DUOX2 mRNA表达水平与 TNF- 组、阴性对照组、空白对照组比较，差异无统计学意义（ P0.05）。结果见
16、表 2、图 3和图 4。 表 2 各组细胞 NOX1、 NOX2、 NOX3、 NOX4、 NOX5、 DUOX1、 DUOX2 mRNA表达水平（ n=3， x s） 组别 NOX1 NOX2 NOX3 NOX4 NOX5 DUOX1 DUOX2 空白对 照 组 0.570.02 0.540.06 0.470.02 0.400.16 0.570.19 0.380.12 0.360.12 TNF-组 0.750.02 0.970.04 0.540.01 0.470.21 0.660.27 0.490.17 0.430.12 GSTM5 质粒组 0.610.08* 0.680.06* 0.510
17、.05 0.420.18 0.660.24 0.480.18 0.430.12 阴性对照组 0.780.05 0.950.02 0.530.03 0.500.25 0.690.29 0.510.16 0.440.13 注：与 TNF-组和阴性对照组比较， *P0.05 图 4 GSTM5 高表达对 NOX3、 NOX4、 NOX5、 DUOX1、 DUOX2 mRNA转录水平的影响 五、 NOX1、 NOX2 蛋白水平的变化 Western blot 结果经灰度值分析后显示： TNF-组 16HBE细胞 NOX1、 NOX 2 蛋白表达较空白对照组明显上调（ 0.990.05 比 0.60 0
18、.08， 1.03 0.13 比 0.66 0.12，皆 P 0. 05）。结果见图 5。 与 TNF-组和阴性对照组比较， *P0.05）。以上结果提示 GSTM5 减轻氧化应激对肺结构细胞的损伤作用可能与下调 NOX1、 NOX2 基因表达密切相关。 综上所述，继发于炎症反应的氧化应激是肺结构细胞破坏的重要因素。 GSTM5 具有抗氧化能力，对炎症诱发的支气管上皮细胞的氧化应激损伤有保护作用，其机制可能与下调 NOX1、 NOX2 基因表达，从而减少氧自由基的生成密切相关。 本研究 为 ALI 的综合治疗提供有益的启示。 参考文献 1 Prabhakaran P， Usatyuk PV，
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