1、慢病毒介导的稳定表达 GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立 及其核转位分析 【 摘要 】 目的 构建稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮 16hbe 细胞株， 探讨谷胱甘肽 S转移酶 mu5（ GSTM5） 核转位的关键因素 。 方法 构建表达 GSTM5 基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒，感染人支气管上皮 16hbe 细胞后，经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆；实时荧光定量 PCR 和蛋白印迹法（ Western-Blot）分别检测细胞株中 GSTM5 的 m RNA、蛋白表达水平；以 TNF- （ 10 ng/mL） 刺激稳转株 1 小时 ， 共聚焦 荧 光 显微镜 检测 GSTM5 核转
2、位。结果：成功构建了重组慢病毒表达质粒 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 并包装慢病毒，感染 16hbe 细胞后经嘌呤霉素筛选得到16hbe-GSTM5-SBP-3flag-N、 16hbe -SBP-3flag-GSTM5-C 细胞株；稳转株 GSTM5 基因的 m RNA 和蛋白表达显著上调； GSTM5 在 TNF- 刺激 后 存在 核转位， 16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N稳转株 核内 GSTM5 的量较另一个稳 转株更大。结论：构建的细胞株能稳定表达 GSTM5 基因， TNF-诱导 G
3、STM5 核转位与其 N 端含有非经典核定位信号密切相关。 【 关键词 】 谷胱甘肽 S转移酶 mu 5； 重组慢病毒表达质粒； 16hbe；核转位 前言 急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)是一 个 具有复杂病理和发病机制的危重症临床综合征 ，其 本质是肺 部 过度失控的炎症反应 1。过度炎症反应引发氧化应激状态，诱导细胞内源性活性氧（ ROS）的生成量剧增 ，超过机体抗氧化系统的清除能力，使机体处于 进行性加重的 氧化应激状态，导致肺结构细胞损伤 2。谷胱甘肽 S转移酶（ glutathione-S-transferase， GST） 与谷胱甘肽结合，是 具有多种功能的催化氧化还原反应的酶 超
4、家族 ，与其他抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作 用 3。 谷胱甘肽 S转移酶 mu 5（ GSTM5）是GST家族的成员 。 本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研 究发现， TNF-刺激 16hbe细胞后 NOX1转录及表达明显上调 8， GSTM5与 NOX1启动子间存在着相互作用 4，这引起了我们对 GSTM5的关注 。 本研究 拟 构建人 GSTM5基因的慢病毒表达载体 及 稳定表达 GSTM5的 人支气管细胞系， 并观察 TNF 刺激 模拟的细胞炎症状态下 GSTM5核转位情况， 为后 续研究 GSTM5的转录调控功能 奠定基础。 材料与方法 一、材料
5、 16HBE、 293T 细胞 、 Stbl3 菌种 由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清 、 DMEM高糖 培养基、胰酶 、 谷氨酰胺 （ Gln） 购于 gibico 公司；重组人 TNF- 购自美国 Pepro Tech公司； BCA 法蛋白浓度测定试剂盒、逆转录试剂 、 PCR、 Real-time PCR 相关试剂 购自 TaKaRa公司；引物由上海英潍捷基公司合成。 慢病 毒系统（含表达载体plvx-puro-kozak-3*Flag-SBPTag2、 plvx-puro-MCS-SBPtag2-3*flag和 2种包装质粒 psPAX2、Pmd2.G)、慢病毒包装专
6、用促转染试剂 FItran 购于辉骏生物；限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶购自 Thermo Scientific 公司； ClonExpress II One Step Cloning Kit 连接酶购自诺唯赞公司；质粒提取和凝胶回收试剂盒为 Qiagen 公司产品。 Trizol 试剂、转染试剂 Lipofectamine 2000 和嘌呤霉素购自 Invitrogen 公司； ECL 荧光底物试剂盒购自美国 Pierce 公司。 抗 flag 荧光抗体（ ab106221） 、 抗 GSTM5 抗体 （ ab112918）购自 abcam。 二、方法 1. 重组慢病毒表达质粒 PLV
7、X-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N 、pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C及慢病毒制备： 根据 GSTM5（ NM_000851）基因序列设计引物（序列见表 1）， 使用 PrimeSTAR 高保真酶扩增基因目的片段。使用微量琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收 pcr 产物。 2 个载体与 Gstm5-F2、 R2 的 pcr 产物进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的基因片段条带和酶切后的载体载体条带，回收纯化，用 T4 DNA 连接酶连接载体 和 目的基因片段，以得到重组慢病毒载体PLVX-puro-GSTM5-
8、SBP-3*flag-N。 使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 无缝连接 GSTM5-F/R 的 pcr 产物及PLVX-puro-3*flag-SBP-C，以得到 pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C。将 10 L 连接产物 加入 至 100 L Stbl3 感受态细胞中 完成连接产物的转化。将 菌液 均匀 涂布于 含 Amp 抗生素（ 100 g/m L）的 LB平板 上， 24 小时后，挑取数个菌落， PCR 检测目的基因表达。取 10ul pcr产物点样到 1% 凝胶 电泳 ，对照 Marker 大小，选取正确的
9、菌落摇菌，测序。并以双酶切鉴定所构建的 2个载体。 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence Primer name Sequence（ 5 -3 ） 酶切 /无缝连接 连接 载体 GSTM5-F GGTACCGCGGGCCCGGGATCCCatgcccatgactctggggtac 载体序列 BamHI 酶切位点 BamHI 与 XbaI酶切载体后无缝连接 PLVX-puro- kozak-3*flag-SBP-C GSTM5-R TacccggtagaattaTCTAGActatttgctgttccatgtagctg 载体序列 XbaI酶切位点 GSTM5-F2 T
10、TC GAATTC GCCACC atgcccatgactctggggtac 酶切位点 kozak EcoRI 酶切 plvx-puro-MCS-SBP-3*flag-N GSTM5-R2 CGA GCGGCCGC Ctttgctgttccatgtagctg 酶切位点 NotI 酶切 测序引物CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 测序引物PGK3 ACTTGTGTAGCGCCAAGTG 2. 慢病毒包装 ： 293T 细 胞在含 10%灭活胎牛血清的 DMEM 培养基中，置于培养箱 37， 5%CO2 培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达 90%以上聚集 度时传代接种于 10c
11、m 细胞培养皿， 5X106 cell/皿（总共 10ml 完全培养基）。 24h 后待细胞密度达 70%-80%时即可用于分盘到 150mm 细胞培养盘。包装当天，即分皿 24h 后，给 293T 细胞换上 20ml 无抗培养基DMEM+10%FBS+4mM Gln， 37、 5% CO2 培养箱培养 2 个小时。 27ug 的慢病毒质粒和 2 个辅助质粒加入 1ml 的生理盐水中轻柔颠倒混合，静止 5min 后并加入质粒 2.5-3 倍转染试剂Polyethylenimine，室温静置孵化 20min 后缓慢均匀滴入 150mm 培养皿中，适当摇 匀；此时记为转染开始时间。转染 4-6h后
12、换液，吸取适量 PBS轻轻漂洗细胞 1-2次，换上培养基 DMEM + 10% FBS+4mM Gln， 1%P/S。 3. 病毒收集 ：转染后 48小时和 72小时分别收集上清， 1000rpm离心 5min，取上清用 0.45um微孔滤器过滤。 4， 25000g超高速冷冻离心机高速离心 2h，弃上清，病毒沉淀用 1mlPBS充分溶解，分装为 100ul/管。滴度测定后 -80 C 冰箱保存。切勿反复冻融，每次冻融大约有10%的损失。 48h 收集的上清可先置于 4冰箱保存。 4. 16HBE/GSTM5 稳定细胞株 感染、 筛选 ： 16HBE 细胞传代 ，取 5 106cells/孔的
13、密度接种至6孔板，接种 4个孔待 16hbe细胞贴壁汇合度为 40%-50%后进行感染；感染前，每孔细胞换成无双抗 1000uL 新鲜的 DMEM 完全培养基含（ 10ug/ml polybrene）， 提高逆转录病毒感染细胞的效率 ，放置于培养箱孵育 1h。取 2 孔细胞分别加入上述制备的 2 种 GSTM5 慢病毒上清液1000ul，第 3孔细胞加 1000ul的空载慢病毒上清液，第 4孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入 37 、 5 CO2、 95%相对湿度的培养箱中 培养 。感染 6 小时后换成新鲜的 DMEM 完全培养基 +1%P/S，待细胞生长至 80%融合度时，加入 1L 的 P
14、uromycin(终浓度 4ug/mL)进行药筛。每天更换含 Puromycin(2ug/mL)完全培养基，直至空白细胞全部凋亡。每次更换细胞培养基均需要加入原药物浓的一半来维持细胞生长，即 Puromycin 的终浓度为 2ug/ml。扩增培养后液氮冻存。至此，筛选得到 16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N， 16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C，16hbe-SBP-3*flag-NC。 5. RT-qPCR 检测 GSTM5 基因表达水平：取上述 3 株细胞及正常 16hbe 细胞铺板后按 life technology 公司提供的 Triozol 使用说明抽提 R
15、NA，紫外分光光度计测定 RNA 浓度后去基因组 DNA，逆转录合成 cDNA。采用实时荧光定量 PCR 两步法定量分析各组细胞 GSTM5 基因 m R-NA 表达水平（引物见表 2）。反应条件：反应条件：预变性 95 3min；变性 95 10 s、退火 60 34 s、延伸 72 30 s，共进行 45 个循环。循环结束后从 60升高到 98获取熔解 曲线。 结果采用公式： - CT=-【 Mean（检测基因 CT 值） -Mean（内参基因 CT 值）】， - CT=-（ GSTM5组 CT NC组 CT），相对表达量 RQ=2- CT。 PCR 引物序列见表 2。 表 2 qPCR
16、引物 基因名称 Genbank ID 引物序列（ 5 -3 ） 扩增长度 GAPDH (内参 ) NM_002046 Forward： GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 226 bp Reverse： GAAGATGGTGATGGGATTTC GSTM5 NM_000851 Forward： CCATCCTGCGCTACATTGC 111 bp Reverse： CCAGCTCCATGTGGTTATCCAT 6.WB 验证： 3 株稳转株及正常 16hbe 分别提蛋白后用 BCA 法测定蛋白浓度， 根据定量结果，每个样本取 20ug 上样， SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后分次孵育抗
17、flag 抗体 （ ab106221） 、 GSTM5抗体 （ ab112918） 。 7.细胞爬片 制作，共聚焦显微镜检测 ： 3 株稳转株及正常 16hbe 分别传代后制作细胞爬片，传代后 24 小时更换含 TNF- （ 10 ng/mL） 不含血清 DMEM 培养基， 1小时后固定细胞，孵育抗 flag 荧光抗体（ ab106221）， 莱卡共聚焦显微镜 绿色荧光分布，即 观察 GSTM5 核转位。 三 、 应用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资料以 x s 表示。数据均进行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析（ One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用
18、LSD 检验法，方差不齐时多重比较采用 Dunnetts T3 检验法， P0.05），见图二。 图 2 RT-qPCR 检测 GSTM5-mRNA 表达变化 3.16hbe-GSTM5 稳转株中 GSTM5 蛋白表达水平分析： Western Blot 检测结果显示，16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N， 16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C细胞中， GSTM5 蛋白表达水平显著高于 16hbe、 16hbe-NC。而后两者之间 GSTM5 表达无明显差异，见图 3。 16hbe-GSTM5 稳转株 GSTM5 蛋白表达水平分析 Flag 抗体孵育 GSTM5 抗体孵
19、育 GAPDH 抗体孵育 1 2 3 4 图 3 1:16hbe； 2： 16hbe-NC； 3：16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C； 4： 16hbe- GSTM5-SBP-3*flag-N 4. 共聚焦显微镜检测： GSTM5 的人支气管上皮细胞株 16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C， 16hbe-SBP-3*flag-NC 的建立。 3 株 稳转株经嘌呤霉素筛选8天后，制作 细胞 爬片后 孵育抗 flag 荧光抗体， 以共聚焦显微镜 观察，所有细胞呈现绿色荧光，表明慢病毒空载体及慢病毒介导的 GSTM5 基因都
20、已整合于全部 16hbe 细胞中。经 TNF- 刺激后，相比 16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C ， 16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N细胞株核内绿色荧光表达较强， GSTM5 核转位较多，见图 4。 图 4 GSTM5表达 共聚焦 荧光 显微镜 检测 讨 论 急性肺损伤（ Acute Lung Injury,ALI）的病理生理过程是炎症反应与氧化应激过度激活的过程，而且炎症反应与氧化应激密切相关 5。炎症失衡诱发了氧化相关基因的过度表达及活性氧过量生成，继发氧化应激损伤，加重了肺结构细胞凋亡 6, 7。在探讨 TNF-诱导肺泡 II型上皮细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
21、磷酸氧化酶 1（ NADPH oxidase 1,Nox1）基因转录调控过程中，发现 TNF-刺激后，肺泡 II 型上皮细胞内 Nox家族及 ROS 表达明显上调 8，同时谷胱甘肽硫 -转移酶 mu5（ Glutathione S-transferase mu 5,GSTM5）表达上调，并从胞浆转移入胞核，与 Nox1 启动子结合 4。 GSTM5 属于 GST 家族，具有催化氧化还原反应的活性 3， 我们前期的 部分研究也证实 GSTM5 能影响 P38、 NF- B 等激酶活化，参与细胞炎症反应 、 凋亡等生理过程的调节 9。我们推测，在 ALI 的发生、 发展过程中， GSTM5 对炎症
22、反应及其继发的氧化应激过程有 具有调控 作用，其机制与 Nox1基因表达密切相关。 为了使 GSTM5基因能够在 16hbe 细胞核中稳定表达，本实验构建 慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株 。相比其它方法，慢病毒感染因具有随机整合到细胞基因组的特性，细胞株的建立更容易，荧光素酶基因的表达更稳定 10，还能确保携带的外源基因不发生改变。慢病毒另一优点是可以同时感染有分裂 能力细胞和无分裂能力细胞，是基因治疗载体的理想方案11，保证了其在在多种细胞中的应用。本研究所构建的 稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，经酶切、 RT-qPCR、 WB 验证，从基因、蛋白方面均证
23、明稳转株构建成功，可用于下一步研究 GSTM5 结构、功能、相互作用蛋白等实验。另外，所构建的载体中有 SBP、 3*flag 标签，可用后续的串联亲和纯化 （ TAP-MS） ，以便分析 GSTM5 的相互作用蛋白，为探究 其功能提供基础。 因为 GSTM5 不具有经典的核定位系列，我们的首要任务是要证实其在 TNF-刺激诱导下能通过直接或间接的 方式入核。 本实验构建 慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株 ，经 TNF-刺激 诱导 后，荧光共聚焦显微镜 显示当 GSTM5 位于标签的 N端时（ 16hbe- GSTM5-SBP-3*flag-N），其核 内 荧光强度较另一
24、个稳转株（ 16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示 GSTM5 的核转位与 N 端结构域密切相关。 当 GSTM5 位于标签的 C端时 入核减少 ， 可能与GSTM5 的 N 端序列 被标签封闭 相关 。 Miho Kawakatsu 等人发现 GSTpi 的线粒体定位序列与其N端相关，其 195-208aa 则对其核定位有重要作用， 并证实其为 一种非经典核定位信号（ NLS）12。 经搜索 expasy 等数据库表明， GSTM5 分 N端和 C端结构域，分别是 1-88aa 和 90-207aa。鉴此，我们认为， GSTM5 的 N 端结构域 含有非经典核定位信号，
25、对其核转位有重要作用 在后续的研究中， 本课题组将分别构建 GV230-GSTM51-88aa-GFP 及 GV230-GSTM5 90-207aa-GFP 载体，进一步研究这两个结构域对 GSTM5 的核转位影响。 综上所述， 本文成功建立了慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株 ，同时证实在 TNF-诱导的炎症过程中 GSTM5 存在 核转位 ，并 与 其 N 端 含有非经典核定位信号密切相关 。 本研究发现为后续 ALI 炎症氧化失衡导致的 肺 结构细胞损伤调控机制的研究 奠定 基础。 参考文献 References: 1. Prabhakaran, P., Acute
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