1、四、五实验大肠杆菌感受态的制备、质粒DNA的转化及转化子筛选授课教师：峰张运授 班课 级： 12技术一、 目的实验 掌握利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态的原理； 掌握质粒DNA转化、转化子筛选的原理； 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。一、 原理实验常用预冷的CaCl2处理细菌制备感受态细胞：用低温（0）低渗CaCl2溶液处理快速生长的细菌，即可获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，外源片段与感受态细胞混合、保温和热激，进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制
2、、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源分子的受体细胞。二、 所需器材和实验 试剂（一） 器 ：仪 设备恒 床温摇 , 恒 培 箱电热 温 养 ,台式高速离心机,无菌工作台,低 冰箱温 , 恒 水浴温 锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液 。枪（二） ：试剂1.LB固体和液体培 基。养2.100mM CaCl2溶液。3. 待 化 粒。转 质三、 步实验 骤1. 挑取一DH5 菌落于单 20ml LB培 液中养 37夜培过 养 。2. 取其中800ul 菌液于一含20mlLB培 液的 形养 锥，瓶 37振 培 至
3、摇 养 OD600 到值达 0.4-0.6之间.3.取1.5ml菌液置于离心管 ，内 4 10000g 离心1min，去掉上清。4 10000g 离心1min4. 加入1ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，反复吸打混匀，使 胞重 ，然后冰浴细 悬 30min.1ml 、100mM的冰冷CaCl25.4 10000g离心5分 收集 胞，然后瞬 离钟 细 时心 去掉 液；最后，加并 残 100uL、100mM的冰冷CaCl2溶液， 反 吸打 浮 胞轻轻 复 悬 细 ,冰上放置3-5min, 即成感受 胞 液。态细 悬6. 感受 胞 且不用 加入等态细 暂 时 V30%的甘油，贮存于-70可保存半年，取其中一 行 化份进 转。加入等V30%甘油
