1、上海交通大学硕士学位论文 摘要 I 上海交通大学硕士学位论文 数字 PCR 在转基因生物及其产品检测中的应用 专 业： 生物学 硕 士 生： 导 师： 上海交通大学生命科学技术学院 年 月 上海交通大学硕士学位论文 摘要 II 摘 要 转基因生物及其产品的标识管理是转基因生物安全管理的重要内容，不同的国家和地区都规定了不同的转基因产品标识阈值，这就对转基因产品的定量检测技术提出了较高的要求。目前，荧光定量PCR 技术在转基因产品的定量检测中广泛应用，但是该方法需要依赖标准曲线和标准物质，是一种相对定量技术，并且定量极限较低，不适用于转基因成分含量低的样品。近年来兴起的数字 PCR 能够通过极度
2、稀释、泊松分布和终点法 PCR 实现绝对定量，并且具有较高的检测极限和定量极限，在转基因生物及其产品的检测中具有巨大的应用潜力。本文围绕两种数字 PCR，分析了 其在转基因生物及其产品检测中的应用。 1. 数字 PCR 可用于转基因生物标准物质的定值：（ 1）微滴式数字 PCR（ ddPCR）在基体标准物质的定值中，能够排除影响反应效率的抑制因子，定值的偏差比荧光定量 PCR（ qPCR）小；（ 2） ddPCR 的动态范围可以达到 100000 拷贝，高于微流体芯片数字 PCR（ cdPCR）；（ 3）微滴式数字 PCR 由于分液数多，在定值的重复性上由于 cdPCR；（ 4） ddPCR
3、具有非常低的检测极限 (0.25 拷贝 /反应 )，能够用于单拷贝分子的检测，而两种数字 PCR 都比 qPCR 具有更低的定量极限；（ 5）酶切后的质粒标准物质更加适合在数字 PCR 平台上进行定值。 2. 数字 PCR 可用于转基因产品的精确定量分析：（ 1） ddPCR 和cdPCR 能够不依赖于标准曲线对转基因产品进行精确的绝对上海交通大学硕士学位论文 摘要 III 定量，同时还可以判断转基因生物的基因型；（ 2） ddPCR 比qPCR 更加适合用于双重定量分析，单重和双重的结果更为接近。 3. 数字 PCR 可用于转基因生物外源基因的拷贝数分析。对于不同的基因，数字 PCR 和定量
4、 PCR 测定的结果有所差异，并且基因组的酶切对数字 PCR 也产生了一定影响。这说明数字PCR 和 qPCR 的反应原理、统计原理有所不同，可以作为 转基因生物外源基因拷贝数的分析的新方法。 关键词 : 转基因 生物，检测，定量，荧光定量 PCR，数字 PCR 上海交通大学硕士学位论文 Abstract IV THE APPLICATIONS OF DIGITAL PCR IN DETECTION FOR GMOS AND THEIR DERIVED PRODUCTS Abstract Labeling management is an important part of regulatio
5、n on genetically modified organisms (GMOs). Thresholds are set by different countries, which need excellent quantification technologies. Currently, real-time quantitative PCR (qPCR) is widely used in quantification of GMOs. However, this method relies on the standard curve and reference material, wh
6、ich lead it to a relative quantification method. Moreover, the limit of quantification of real-time PCR is high. Samples with low GMO content cannot quantified by qPCR. Digital PCR (dPCR) can realize absolute quantification through limit dilution, Poisson distribution and endpoint PCR. It shows pote
7、ntial in GMOs detection. In this research, two kind of digital PCR platforms were applied in GMO detection. 1. Digital PCR can apply in determing the certified value of GMO reference material. (1)Droplet digital PCR (ddPCR) can exclude matrix effect of qPCR and obtain the certified value with a smal
8、ler bias than qPCR. (2) ddPCR had a higher dynamic range (within 100,000 copies) than chamber digital PCR (cdPCR). (3) ddPCR presented a good repeatability on certified value than 上海交通大学硕士学位论文 Abstract V cdPCR, attribute to the more partitions. (4) ddPCR had a low limit of detection (0.25 copies/rea
9、ction). Both ddPCR and cdPCR had a lower limit of quantification than qPCR. (5) Digtal PCR can work better on degisted plasmid reference material. 2. Digital PCR can apply in accurate quantification of GMO products. (1) Both ddPCR and cdPCR can realize absolute quatification of GMOs products wihout
10、standard curve and reference materials. Moreover, digital PCR can decide the genotype of GMOs. (2) ddPCR performed better than qPCR in duplex quantification. The results of simplex and duplex on ddPCR were closer than qPCR. 3. Digital PCR can apply in estimating copy number of transgenes in GMOs. Di
11、gital PCR and qPCR tested different copy number on some genes. The degistion of genome had an effect on digtal PCR instead of qPCR. Thus, digital PCR was different form qPCR on principle and data statistics. Digital PCR can act as a new method in estimating copy number of transgenes in GMOs. Keyword
12、s: GMOs, detection, quantificaiton, real-time PCR， digital PCR 上海交通大学硕士学位论文 第一章 6 目 录 摘 要 . II ABSTRACT . IV 目 录 .6 第一章 转基因生物及其定量方法研究进展 .8 1.1 转基因生物发展现状 .9 1.1.1 全球转基因生物发展现状 . 9 1.1.2 中国转基因生物发展现状 . 10 1.2 转基因生物及其产品的标识管理 . 11 1.2.1 强制性标识 . 11 1.2.2 自愿性标识 . 12 1.2.3 低水平混杂的管理 . 13 1.3 转基因生物及其产品定量检测方法概述
13、 . 13 1.3.1 转基因成分含量表述方式 . 13 1.3.2 荧光定量 PCR. 14 1.3.3 数字 PCR. 16 1.3.4 数字 PCR及其应用 . 21 1.3.5 展望 . 22 第二章 数字 PCR在转基因生物标准物质定值中的应用 . 23 第一节 通过数字 PCR 对转基因生物基体标准物质定值 . 24 2.1 实验材料、试剂与仪器 . 24 2.1.1 实验材料 . 24 2.1.2 实验仪器 . 24 2.1.3 实验试剂 . 25 2.2 实验方法 . 25 2.2.1 三种方法提取植物基因组 DNA. 25 2.2.2 DNA质量评价方法 . 26 2.2.3
14、 引物和探针的设计 . 28 2.2.4 荧光定量 PCR的反应体系和条件 . 28 2.2.5ddPCR反应体系和条件 . 29 2.2.6cdPCR反应体系和条件 . 30 2.3 实验结果与讨论 . 30 2.3.1 三种抽提方法所得 DNA 质量评价 . 30 2.3.2 荧光定量 PCR定值结果 . 32 2.3.3 ddPCR 定值结果 . 34 2.3.4cdPCR 定值结果 . 35 2.3.5 三种平台定值结果的分析比较 . 36 2.3.6 数字 PCR平台性能的分析 . 37 2.4 小结 . 43 第二节 通过数字 PCR 对转基因生物质粒标准物质定值 . 44 2.1
15、 实验材料、试剂与仪器 . 44 上海交通大学硕士学位论文 第一章 7 2.1.1 实验材料 . 44 2.1.2 实验仪器 . 44 2.1.3 实验试剂 . 44 2.2 实验方法 . 44 2.2.1 提取质粒分子 DNA . 44 2.2.2 DNA 质量评价方法 . 45 2.2.3 质粒分子的酶切及回收 . 45 2.2.4 引物和探针的设计 . 45 2.2.5 荧光定量 PCR的反应体系和条件 . 46 2.2.6ddPCR反应体系和条件 . 46 2.2.7cdPCR反应体系和条件 . 46 2.3 实验结果与讨论 . 46 2.3.1 酶切结果及 DNA 质量评价 . 46
16、 2.3.2 荧光定量 PCR定值结果 . 47 2.3.3ddPCR定值结果 . 47 2.3.4cdPCR定值结果 . 48 2.3.5 三种平台定值结果的分析比较 . 49 2.4 小结 . 50 第三章 数字 PCR 在转基因产品精确定量中的应用 . 51 第一节 数字 PCR 可用于转基因生物基因型的分析 . 52 3.1 实验材料、试剂与仪 器 . 52 3.1.1 实验材料 . 52 3.1.2 实验仪器 . 52 3.1.3 实验试剂 . 52 3.2 实验方法 . 52 3.2.1 提取植物基因组 DNA . 52 3.2.2 DNA 质量评价方法 . 52 3.2.3 引物和探针的设计 . 53 3.2.4 荧光定量 PCR 的反应体系和条件 . 53 3.2.5ddPCR 反应体系和条件 . 53 3.2.6cdPCR 反应体系和条件 . 53 3.3 实验结果与讨论 . 53 3.3.1DNA 质量评价 . 53 3.3.2 荧光定量 PCR 定量结果 . 54 3.3.3ddPCR 定量结果 . 54 3.3.4cdPCR 定量结果 . 55 3.3.5 三种平台定量结果的分析比较 . 56 3.4 小结 .
