(完整版)细胞实验技术.docx

（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10XMbuffer1H2O35ul水浴锅100r2min,锅里隔夜三）、酶切plko.1载体1、AgeI酶切，反应体系plko.1载体4ugAgeI2ul10XAgeIbuffer5ulH2O39ul37C水浴23h2、切胶回收AgeI酶切产物，30ul水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI酶切产物30ulEcoRI2ul10XHbuffer5ulH2O13ul37C水浴23h切胶回收，30ul水洗脱，测浓度四）、连接连