1、 JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本 科 毕 业 论 文 题目 ： 没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全 班 级： 指导教师： XXXX 职 称： XX 二 0 XX 年 X 月 没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究 目录 摘要 . I Abst r act . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II 引言 . . . .
2、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 实验材料 . . 3 1.2 仪器设备 . . 3 1.3 实验方法 . . 4 1.3.1 GASe 溶胶的制备 . 4 1.3.2 GASe 纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定 . 4 1.3.3 细菌培养基的制备 . 4 1.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备 . 5 1.3.4 滤纸片法测定 GASe 溶胶
3、抑菌活性 . 5 1.3.5 带毒平板法测定 GASe 溶胶抑菌活性 . 5 1.3.6 半数抑菌浓度 . 5 3 结果与分析 . . 6 3.1 GASe 溶胶的浓度测定 . 6 3.2 GASe 溶胶抑菌活性 . 7 3.4 半数抑菌浓度 . 11 3 结论 . . 12 参 考 文献 . 14 致谢 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 没食子酸修饰的纳米 硒
4、抑菌作用研究 摘要 本文通过在酸性条件下加热没食子酸 (Gallic acid， GA)还原亚硒酸钠制得没食子酸修饰的纳米硒（以下简称 “GASe”）。利用高相液相色谱法测定 GASe 颗粒表面 的 GA 的浓度后，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法测定其对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌的抑菌效果。结果表明低浓度的 GASe 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌都有抑菌效果，随 GASe 的浓度的增大其抑菌能力随之提高， GASe 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的半数抑菌浓度分别是 0.9710-4mol/L 和 2.07710-3 mol/L。 GASe 的抑菌效果优于没食子酸单体。说明 GASe 有望
5、成为一种高活性的纳米类抗菌抑制剂。 关键词 ： GASe 抑菌作用 半数抑菌浓度 I 没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究 Abstract In this paper, gallic acid modified selenium nanoparticle (“GASe“) was prepared by heating gallic acid (GA) and Na2SeO3 under acidic conditions. The concentration of GA on GASe was determined by high performance liquid chromatograp
6、hy (HPLC), then using zone of inhibition assay, radial growth assay and turbidity method to determine the antibacterial effect of GASe on E. coli and S. aureus. The results showed that the low concentration of GASe had the antibacterial effect on E.coli and S. aureus, and the antibacterial activity
7、of GASe displayed concentration-dependent behavior. 50% inhibitory concentration (IC50) of GASe to E.coli and S. aureus were 2.077 10-3mol/L and 0.97 10-4mol/L, respectively. The antibacterial effect of GASe was better than that of GA. Therefore, GASe is expected to be a highly active nano antibacte
8、rial agent. Keywords: GASe, Antibacterial effect, 50% inhibitory concentration II 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 引言 在我们周围环境中，到处都有各种各样的微生物生存着，绝大多数是对人类无害的微生物，其中有一部分是对人类有害的微生物。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等是食品、医疗卫生中常见的致病菌。大肠杆菌在食物中超标，不仅会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，还会引起呕吐，腹泻，痢疾等肠道疾病；金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可以起肺炎，心包炎等，甚 至败血症，脓毒症等全身感染 ,
9、严重时会致人死亡。美国疾病防制中心（ CDC）指出，金黄 色葡萄球菌是目前最难以对付的病菌之一。正由于细菌感染会严重威胁着人类的生命和健康，对这些有害微生物必须采取有效的措施来防止，杀灭或抑制它们。自从抗生素的诞生及广泛使用，许多细菌感染性疾病得到了及时有效的预防、控制和治疗。但是，随着抗生素的大量使用，细菌耐药性菌株越来越多，耐药范围越来越广，甚至出现了一些能对绝大多数抗生素不敏感的超级耐药菌株，这些问题已成为危害人类生 存和发展的最大危机。我们国家是世界上抗生素滥用最严重的国家之一，每年约有 8 万人死于抗生素泛滥使用导致的不良反应，且这个死亡数字每年都在不 断增加，细菌耐药问题比其他国家
10、更加严峻。因此，研制新型非抗生素类抑菌剂已经刻不容缓。非 抗生素抗菌剂的研究开始于 20 世纪 80 年代初 1，近几年，人们研制了许多非抗生素类的抑菌剂，如阳离子聚合物 2-7，抗菌肽 8-10及具有光热杀菌效果的试剂 11,12等等。虽然这些非抗生素药物表现出一定的抑菌作用，但是仍存在一些缺点。例如，阳离子聚合物表现出一定程度的体内溶血，使得其难以作为一个无毒副作用且有效的抗菌物 质 13 ，而抗菌肽虽然是天然的抗菌剂，但在生理条件下易被降解。正由于这些问题 ，寻找安全、有效的非抗生素类抑菌剂已成为医学研究的一个主要目标。 没食子酸是一种天然的多酚类化合物，具有抗氧化，抑菌等生物活性 14
11、，具有强 还原性，但是没食子酸不稳定，易与空气中的氧气反应变成褐色 15。硒是一切生物所必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，亚硒酸钠对金黄葡萄球菌有抑 菌作用，且随浓度的增大抑菌能力增强 16。然而亚硒酸钠毒性大，稳定性差。硒能以多种化学形式存在于生物体内，硒的生物活性和毒性与它的化学形态有关。相对于有 机硒和无机硒，红色的零价态纳米硒溶胶具有低毒性， 高生物活性和高利用价值 17-18。 为获取稳定的纳米硒材料，其有效办法之一是加入无毒安全的表面活性剂作为修饰剂。 1 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 纳米粒子间存在不同于常规粒子间的纳米作用能。这种纳米粒子作用能是因为纳米粒子的表
12、面缺少邻近配位原子造成的，使纳米粒子具有很高的活性。随着近年来纳米技术的不断发展，纳米材料类抗菌剂的研究也得到一定的进展，而且纳米材料具备吸附 病毒细菌、病毒、有机物的能力 19。以纳米粒子为基础的抗菌剂由于其抗菌特性和在 人类的细胞中较低的毒性已成 为目前国内外的研究热点 20。没食子修饰的纳米硒可以克服没食子酸易被氧化和亚硒酸钠不稳定及毒性较大等缺点，因此本论文选用没食子 酸修饰的纳米硒溶胶（ GASe）作为研究对象，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法研究其抑菌效果。结果表明 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果， 而且 GASe 溶胶的抑菌效果也比没食子酸单体好。因此， GA
13、Se 溶胶有望成为一种有高效、安全的新型抗菌材料。 2 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 1 材料与方法 1.1 实验材料 没食子酸 天津市大茂化学试剂厂 亚硒酸钠 郑州鸿祥化工有限公司第一分公司 盐酸 西陇化工股份有限公司 氢氧化钠 天津欧博凯化有限公祠 甲醇（色谱纯） 天津永大化学试剂有限公司 磷酸 天津永大化学试剂有限公司 蛋白栋 北京奥博星生物技术有限公司 牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公司 琼脂粉 上海山浦化工有限公司 氯化钠 天津市大茂化学试剂厂 1.2 仪器设备 SPECORD 200 紫外可见光分 光光度计 德国耶拿分析仪器股份公司 JD 1000-2 电子天平 沈阳龙腾电子有限
14、公司 立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 HH-BII-600 电热恒温培养箱 上海跃进医疗机械厂 GZX-DH-600-S 恒温干燥箱 上海跃进医疗机械厂 SW-CJ 系列洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 安捷伦 1260 型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司 SYMMETRYC18 色谱柱 (4.6nm250nm,5m) 美国安捷伦科技公司 BCD-5 50WKM 电冰箱 合肥美的荣 事达电冰箱有限公司 SHA-C 水浴恒温振荡器 金坛市天竟实验仪器厂 90-1 型恒温磁力搅拌器 上海泸西分析仪器厂有限公司 3 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 1.3 实验方法 1.3.
15、1 GASe 溶胶的制备 参考已发表的文献进行 GASe 的合成制备 21。用电子天平称取 0.18814g 没食子酸至 250mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到 100mL，配成 0.01mol/L 的没食子酸储备液。 用电子天平称取 0.17294g 亚硒酸钠至 50mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到 10mL，配成 0.1mol/L 的亚硒酸钠储备液。 在 25mL 烧杯中按 1： 6 的浓度加入 Na2SeO3 与没食子酸，利用盐酸将 pH 调至 3.0 后，加热挥干后得到橙红色固相样品。将此样品加蒸馏水溶解，在透析袋中过夜透析 除去未反应的没食
16、子酸后，定容于 10mL 容量瓶中得到 GASe 溶胶。 1.3.2 GASe 纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定 用电子秤称取 2mg， 4mg， 6mg， 8mg， 1.0mg 没食子酸至小烧杯后加入 10mL 超纯水溶解，得到 0.2mg/mL,0.4mg/mL， 0.6mg/mL,0.8mg/mL,1.0mg/mL 的没食子酸溶液。 取 2mLGASe 溶胶 至离心管中， 1 万转 /min 离心 10 分钟后取上清液 10L 进样。 将以上配制好的 5 种不同浓度的标准品没食子酸溶液分别进样，每种浓度进样 3 次，每次进样 10L，每次进样前经滤膜过滤，测定峰面积。将上清液稀释 5
17、 倍后再进样。以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算出 GASe 溶胶中没食子酸的浓度，从而计算出 GASe 的浓度。 色谱条件： SYMMETRYC18 色谱柱 (4.6nm250nm,5m)柱温 30 ，流动相为 V(甲 醇 )： V（ 0.05%H3 PO4） =15： 85 溶液，检测波长为 273nm，进样量为 10L。 1.3.3 细菌培养基的制备 称取 0.5g 牛肉膏， 1g 蛋白胨及 0.5g 氯化钠溶解定容到 100mL，调节 pH 至 7.2（配制固体培养基需加入 1.5 2g 琼脂粉），在 0.1MPa 下高压灭菌 20min，备用22。
18、 4 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 1.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备 将金黄色葡萄球菌菌种和大肠杆菌菌种接入试管斜面上，在 37 的恒温培养箱内 培养 24 小时后，置于 4 冰箱中冷藏备用。将 2 个配制好的 100mL 液体培养基经过121 高压灭菌 20min，在室温下冷却至不烫手。在无菌条件下，用接种环挑取一环置于液体培养基中，于 37 恒温培养箱中培养 24 小时作为种子液，不用时置于 4冰箱中冷藏备用。 1.3.4 滤纸片法测定 GASe 溶 胶抑菌活性 选用优质滤纸片直径为 6mm 的圆形纸片分别装入 6 个小离心中，其中 3 个分别加 入 50L， 100L， 150L
19、的 GASe 溶胶，另外三个加入相同量相同浓度的没食子酸溶液，置于 62.5 的烘箱中烘干。取菌悬液 0.2mL 转移至之前倒好的平板培养基表面，涂布均匀，制成含菌平板。将烘干的滤纸片贴入含菌平板，每个平板贴 3 片。在 37 的恒温培养箱中培养 24 小时后观察它们的抑菌效果。 1.3.5 带毒平板法测定 GASe 溶胶抑菌活性 移取 0.2mL 金黄色 葡萄球菌菌悬液到 10 个经 0.1MPa 高温灭菌 20min 的培养皿，移取 0.2mL， 0.4mL， 0.6mL， 0.8mL， 1.0mLGASe 溶胶到已灭菌的装有 14.8mL， 14.6mL，14.4mL， 14.2mL，
20、14mL 培养基的小锥形瓶中得到 GASe 浓度分别为 2.414610-5mol/L,4.829010-5mol/L,7.243410-5mol/L,9.657810-5mol/L ， 12.072310-5mol/L 的带毒平板。对照组用等量的无菌水代替 GASe 溶胶，其它不变，迅速摇匀，将培养基倒入培养皿中，贴好标签。放入 37 的恒温培养箱中培养 24 小时，观察结果。制备好大肠杆菌的菌悬液后，用相同的方法进行测定 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌活性。 1.3.6 半数抑菌浓度 培养基中含有 GASe 溶胶的吸光值的测定：分别移取 0.1mL， 0.2mL， 0.3mL， 0.4mL
21、， 0.5mLGASe 溶胶到已灭菌的装有液体培养基 4.9mL， 4.8mL， 4.7mL， 4.6mL， 4.5mL 的试管中，在 37 的振荡器中振荡 8 小时，在 600nm 处测定吸光值，以 GASe 的浓度为横坐标轴，以吸光值为纵坐标轴根据 GASe 的浓度和吸光值的关系，绘制 5 没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用 标准曲线。 半数抑菌浓度的测定：分别移取 0.1mL， 0.2mLGASe 溶胶到已灭菌装有液体培养基 4.9ml,4.8ml 的试管中 ,向每个试管移取 0.1mL 的金黄葡萄球菌的菌悬液使得 GASe 浓度分别是 3.490210-4mol/L， 6.980310-4
22、mol/L。在 37 的振荡器中培养 8 小时，观察其浑浊度。分别移取 10L， 30L， 50L， 70L， 90LGASe 溶胶到 6 个分别装有已灭菌的液体培养基 5ml 的试管中，向每个试管移取 0.1ml 的金黄葡萄球 菌的菌悬液使得 GASe 浓度分别是 0.348310-4mol/L ， 1.04110-4mol/L ，1.728210-4mol/L， 2.410110-4mol/L， 3.086710-4mol/L。在 37 的振荡器中培养 8 小时。对照组用等量的无菌水代替 GAse 溶胶，其它不变。观察浑浊度以及 在 600nm 处测定吸光值。此方法平行测定三次。 分别移取
23、 1.1mL， 1.2mL GASe 溶胶到已灭菌的 3 个装有液体培养基 4mL 的试管中，向每个试管移取 0.1mL 的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是 3.765410-3mol/L， 4.030210-3mol/L。在 37 的振荡器中培养 8 小时，观察浑浊度。分别移取 0.6 mL， 0.7 mL， 0.8 mL， 0.9 mL， 1 mLGASe 溶胶到已灭菌装有液体培养 基 4.4 mL， 4.3 mL， 4.2 mL， 4.1 mL， 4 mL 的试管中，向每个试管移取 0.1mL 的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是 2.094110-3mol/L ，
24、 2.443110-3mol/L ， 2.792210-3mol/L， 3.141210-3mol/L， 3.490210-3mol/L。在 37 的振荡器中培养 8 小时。对照组用等量的无菌水代替 GAse 溶胶，其它不变。观察浑浊度以及在 600nm 处测定吸光值。此方法平行测定三次。 GASe 溶胶的吸光值记为吸光值 1，对照组的吸光值记为吸光值 2，含 有 GASe 溶胶和细菌吸光值记为吸光值 3。根据公式：抑菌率 (%)=吸光值 2-(吸光值 3-吸光值 1)/吸光值 2，以 GASe 浓度为横坐标，以抑菌率为纵坐标，绘制标准曲线，并依据 回归方程计算出抑菌率为 50%时的浓度即为半数抑菌浓度。 3 结果与分析 3.1 GASe 溶胶的浓度测定 采用高效液相色谱法检测 GASe 纳米粒子表面所负载的没食子酸浓度。的标准 曲线图如图 1，根据没食子酸的回归方程 y=26266x-920.44 和 GASe 溶胶上清液释释 5 倍后所得峰面积为 5522.5 计算出 GASe 溶胶中纳米颗粒表面所负载的没食子酸浓 6
