1、 1 摘 要 在生物脱氮过程中，反硝化能利用 NO3-作为电子受体，而在实际应用中，生物除磷可以结合生物脱氮， 利用 NO3-作为电子受体 氧化胞内贮存 PHB 产生能量 ,从而进行过量吸磷 ， 仅少量文章报道过此 类 研究。 本试验 研究 在间歇式反应器中 ，以 NO3-为电子受体 的反硝化聚 磷菌 （ DPB） 的 生理生化特性 、好氧吸磷功能， 同时对其反硝化聚磷性能进行了考察。 试验 结果表明： (1)好 氧聚磷菌（ PAO） 经 驯化诱导后 不但具有反硝化产氮特性，而且具有好氧聚磷特性 ； (2)在传统的 A2/O 工艺中存在 有以NO3-为电子受体的 反硝化聚磷菌 ； (3)在驯化
2、 过程 中分离 到 的 兼性厌氧微生物有 棒状杆菌属、 假白喉棒杆菌、葡萄球菌属及莫拉氏菌属， 且 都 有 不同程度的 反硝化聚磷功能 。 关键词 ： 硝酸盐 反硝化聚磷菌 好氧吸磷 2 目 录 1 前言 4 2 试验材料与方法 5 2.1 试验设备及装置 5 2.2 试验材料 6 2.2.1 菌种来源 6 2.2.2 培养基的配方 6 2.2.3 好氧吸磷 试验用液 6 2.2.4 吸磷试验用液 7 2.3 试验方法 7 2.3.1 好氧吸磷 试 实 验操作步骤 7 2.3.2 吸磷试验操作步骤 7 2.3.3 反硝化聚磷菌的生理 生化 指标 7 2.3.4 各菌株的鉴定归属 11 2.3.
3、5 试验分析方法 11 3 结果与讨论 11 3.1 反硝化聚磷菌的筛选 11 3.2 反硝化聚磷菌的生理生化鉴定 11 3.2.1 第一阶段 (A/O)细菌的鉴定 11 3.2.2 第二阶段 (A/N)细菌的鉴定 13 3.2.3 第三阶段 (A/N)细菌的鉴定 15 3.2.4 各阶段菌属 PO43-P的平均去除率的对比 17 3.3 反硝化聚磷菌的特性研究 18 3.3.1 第一阶段 (A/O)菌株的吸磷试验 18 3.3.2 第二阶段 (A/N)菌株的吸磷试验 19 3.3.3 第三阶段 (A/N)菌株的吸磷试验 20 3.3.4 各阶段各菌属 PO43-P去除率的分析 21 4 结论
4、 22 致 谢 23 3 参考 文献 24 英文摘要 25 学生承诺书 26 成绩评定表 27 4 1 前言 传统 的工艺认为生物反硝化脱氮和生物除磷是两个独立、相互竞争的生理过程。微生物除磷的基本原理是利用聚磷菌（ Phosphorus Accumulating Organism, 简称PAO）在“厌氧放磷 ,好氧吸磷”的生理特点 ,使活性污泥交替处于厌氧、好氧的状态下达到除磷目的。微生物脱氮的基本原理是利用反硝化菌在“好氧硝化、亚硝化 ,缺氧反硝化”的生理特点 ,把各形态氮转化为氮气，达到脱氮 的 目的。但在实际的研究过程中，何为反硝化菌，何为聚磷菌，不同的研究者有不同的论点。有研究认为反
5、硝化菌包括变形杆菌、微球菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属等，但也有研究认为莫拉氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等才是主要的反硝化菌 1。对于聚磷菌， Fuhs 和 Chen 早于 1975 年进行了研究 ,他们 认为生物除磷菌是不动杆菌 2，但后期研究者认为属于莫拉氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等 1。 Megnack 3、清华大学周岳溪等人 4、华东师范大学朱怀兰等人 5研究结果却表明 ,除磷菌有假单胞菌属、气单胞菌属、棒状菌群和肠杆菌科。 硝酸盐还原性和超量吸磷只是两种并不冲突的细菌生化特性，也可同时拥有这两种生化特性。因此，反硝化菌和聚磷菌之间并无严格区分，可相互交叉，其交叉点是反硝
6、化聚磷菌 DPB(denitrifying phosphorus removing bacteria，简称 DPB)。由细菌 完成的生物脱氮和生物除磷是两个既相对独立又相互交叉的生理过程，其交叉点是同时拥有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的细菌（ DPB）进行的反硝化除磷脱氮生化反应 1。 最近一些研究表明，至少存在一部分聚磷菌可以在缺氧条件下利用硝酸盐作为电子受体进行吸磷。 因此 Kerrn-Jespersen 把聚磷菌划分为两类 ， 一类仅仅可以利用氧作为电子受体 ;而另一类既可以利用氧 ， 也可以利用硝酸盐为电子受体 6。 国内外学者 纷纷提出反硝化聚磷过程是可以相互结合的，以达到处
7、理工艺 减少曝气量，节省能耗，减少运行费用，剩余污泥少等 ，但大多的学者研究反硝化聚磷是针对污泥这个复合菌体，而针对单菌株的反硝化聚磷的研究比较少。 本 研究 的目的是对 经过驯化试验的 反硝化聚磷菌的筛选 、分离及纯化，并对分离出的细菌进行生化指标的鉴定，以确定反硝化聚 磷 菌的菌属 ，并研究 单菌株的吸磷特性 。 5 2 试 验 材料 与方法 2.1 试验设备 及装置 试验设备见表 1，实验 采用静态的厌氧 /缺氧装置 见图 1. 表 1 设备详细资料表 Tab1 Equipment 设 备 型 号 厂 家 单人单面净化工作台 SW CJ IFD 苏州净化设备有限公司 上皿电子天 平 FA
8、1004 上海天平仪器厂 压力蒸汽消毒器 YX280B 上海三申医疗器械有限公司 生化培养箱 LRH-250A 广东省医疗器械厂 全温振荡器 HZQ-QX 型 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 氮气瓶（工业氮） 广钢集团广州气体厂有限公司 离心沉淀器 80-1 型 江苏国华仪器厂 微孔滤膜 孔径： 0.45 m 浙江省海宁市盐宫钱江医疗器材厂 离子分析仪 PXST-216 型 上海精密科学仪器有限公司 磁力搅拌器 JB-1A 上海精密科学仪器有限公司 铂电极 213 型 上海精密科学仪器有限 公司 硝酸根选择电极 手提式氧化还原测定仪 TS-2 上泰仪器（昆山）有限公司 参比电极 213 型 上
9、海精密科学仪器有限公司 紫外可见分光光度计 752C 型 上海第三分析仪器厂 冰箱 BCD-215HC 华凌 图 1 静态厌 /缺氧反应装置图 Fig1 the anoxic and anaerobic installation 1.氮气瓶 2.加药管 3.取样口 4.反应瓶 5.水封 2.2 试验材料 2.2.1 菌种来源 试验采用间歇式反应器， 活性污泥取自某污水处理厂生物反应池厌氧段中段的6 污泥 ，分 3 个阶段，对在缺氧环境下利用 NO3-作为电子受体的反硝化聚磷菌 (DPB)进行选择和富集。 第一阶段以厌氧 /好氧 (A/O)方式启动运行，每天运行 4 周期，每个周期 6 小时，共
10、运行 20 周期。目的是使系统中的活性污泥中在此条件下具有高效的好氧除磷效果污泥。 第二阶段采用厌氧 /缺氧 (A/N)方式运行，每天运行 3 周期，每个周期 8 小时，共 运行 103 周期。该阶段的目的是对 反硝化聚磷菌进行选择和富集。进入缺氧阶段时系统内氮源磷源的投加量按 N:P=2:17投加。 NO3-以分段的形式向体系流加。第二阶段污泥浓度为 3500 4000 mg/L，污泥龄控 制在 16 天左右。 第三阶段采用厌氧 /缺氧 (A/N)沉淀运行方式，每天运行 3 周期，每个周期 8 小时，共运行 20 周期 。 本 试验 采用 第 一 、 二 、 三阶段 最后一 周期 污泥为种泥
11、，经分离纯化后的纯菌株作为研究对象 。 2.2.2 培养基 的 配方 （ 1） 牛肉浸膏蛋白胨培养基 配方： 牛肉浸膏 1.5g， 琼脂 9g， 蛋白胨 5g， 氯化钠 2.5g， 蒸馏水 500ml，pH=7.0 7.2， 121灭菌 20min。 用途：用于活化菌株。 （ 2） 聚磷菌筛选培养 液 8 配方： 无水乙酸钠 2.5g， KH2PO4 0.125g， MgSO4-7H2O 0.25g， CaCl2-H2O 0.1g，（ NH4） 2SO4 1.0g， 微量元素 0.5ml， 蒸馏水 500ml， pH=7.0 7.2， 121灭菌 30min。 用途：用于 好氧 吸磷 和吸磷试
12、验。 2.2.3 好氧吸磷 试验 用液 将各 阶段最后一周期分 离、纯化得到的纯菌株 ，经过革兰氏染色和菌落特征观察合并后得到的纯菌株活化（ 30培养 24h），在无菌操作室内将活化好的菌挑取三环于灭好菌的聚磷菌筛选培养液内 。 2.2.4 吸磷试验用液 将通过 好氧 吸磷 试验具有较强好氧聚磷功能的 PAO 活化（ 30培养 24h），在无菌操作室内将活化好的菌挑取三环于灭好菌的聚磷菌筛选培养液（ 500ml）内。 7 2.3 试验 方法 2.3.1 好氧吸磷 试 实 验操作 步骤 8 （ 1）将 2.2.3 的试验用液置于 30， 140rpm/min，摇床预培养 24h。 （ 2）将（
13、1）步中的培养液在无 菌操作室内测量其 OD 值，并用无菌水调节 OD使培养液中细菌数为 1010 个 /ml，然 后取 10ml 接入灭好菌的聚磷菌培养液。将其置于30， 140rpm/min，进行 好氧 吸磷 试验，在 0,24,48,72h 分别取少量培养液测量其ORP，然后 4000 转离心 20min 后取上清液，测量其当时的 TP、 PO43-P、 COD 值。 2.3.2 吸磷 试 验操作步骤 将 2.2.4 的 试验用 液 置于自制厌氧 /缺氧 密封装置中，往 试 验用液中先通入氮气，起搅拌 和驱赶反应液中氧气的作用，在 0 min 取样后快速测定其 ORP 值 ，然后用离心沉
14、淀器将菌与 水样分开，取上清液置于布式漏斗过 0.45 m的 微孔 滤膜，测定滤液中的 COD 值 、 PO43-P 和 NO3- N 的浓度 ； 然 后向 装置 投加 硝酸盐 以提供 NO3-作为电子受体， 其中 硝酸盐 的投加量 是根据试验用液中的 PO43-P 的含量进行投加，其 N： P 比 则根据需要按一定的比例投加 。 （注意：投药时 直接用 医用滴管 投加 ， 以减少空气进入反应装置影响 试 验）。继续通氮气进行缺氧反硝化吸磷实验，在 2、 5、10、 20、 30、 45、 60、 90、 120、 150min 分别 取样后快速测定其 ORP 值 ，然后用离心沉淀器将菌与水样
15、分开，取上清液置于布式 漏斗过 0.45 m的 微孔 滤膜，测定滤液中的 COD、 PO43-P和 NO3-N的浓度 。 注： ORP 值为 200 100mV，为好氧环境； ORP 值为 100 -100mV，为缺氧环境； ORP值为 -100 -200mV，为厌氧环境。 2.3.3 反硝化聚磷菌 的 生理 生化 指标 9 （ 1） 革兰氏染色 染剂 ： 结晶紫的混合液 ， 碘液 ， 95%的乙醇 ， 番红 染 液 。 操作 ： 用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干（切勿温度太高）固定 用结晶紫的混合液染 1min后，用水冲洗 碘液 作用 1
16、min，水洗，吸干 用 95%乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色（约 30s） 用番红溶液染 1min，水洗，风干 镜检（油镜） 。 结果观察 ： 深紫色为革兰氏阳性细菌；红色为革兰氏染色阴性细菌。 注意：染色用的菌种要培养 18 24h 的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结果。且染色要用已知 革兰氏染色 结果的菌种（ G+，苏云金杆菌和 G-，大肠杆菌）8 与待测定的菌种做对比。 （ 2） 硝酸盐还原测试 培养基 ： 牛肉膏 0.75g，蛋白胨 1.25g， KNO3 0.25g，蒸馏水 250ml， pH=7.07.6。 每管分 装 4 5ml， 121蒸气灭菌 15 20min。 试剂
17、 ： 格里斯氏试剂 A 液：对氨基苯磺酸 0.5g，稀醋酸（ 10%左右） 150ml； B 液：萘胺 0.1g，蒸馏水 20ml，稀醋酸（ 10%左右） 150ml； 二苯胺试剂 二苯胺 0.5 g溶于 100ml 浓硫酸中，用 20ml蒸馏水稀释。 接种 ： 将测定的菌种接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养 1， 3， 5 天。另留一管不接种作对照。 操作 ： 取一支干净的空试管，倒入少许培养 1， 3， 5 天的培养液，各加一滴 A液和 B液，在对 照管中同样加入 A 液， B液各一滴。 结果观察 ： 当培养液滴入 A， B液后，溶液如变成粉红色，玫瑰红色，橙色，棕色等表示亚硝酸盐存在，
18、为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂，此时如有蓝色反应，则表示培养基中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。 （ 3） 亚硝酸盐还原测试 亚硝酸盐培养基的制备 ： 牛肉膏 10g，蛋白胨 5g，蒸馏水 1000ml，亚硝酸钠 1g，pH=7.3 7.4。分装试管， 121蒸气 灭菌 15min。 试剂 ：同硝酸盐相同 接种 ： 将测定的菌种接种于亚硝酸盐液体培养基中，置 30培养 1， 3， 7天 后测定 。 结果观察 ： 加试剂 A液和 B液各一滴，如红色消失而产氨则
19、为阳性，加试剂为红色说明不分解亚硝酸盐为阴性。 （ 4） 葡萄糖氧化发酵测定 休和利夫森二氏培养基 ： 蛋白胨 2g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 0.2g，葡萄糖 10.0g，9 琼脂 6.0g，溴百里酚蓝 1%水溶液 3ml（先用少量 95%乙醇溶解后，再加水配成 1%的水溶液），蒸馏水 1000ml。 pH=7.0 7.2，分装试管，培养基高度约为 4.5cm， 115蒸气 灭菌 20min。 接种 ： 以 18 24h 待测的幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株 2支。其中一支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的 2/3 凡士林中加入 1/3 液体石蜡，高压灭菌）封盖，以隔绝空气为闭管。另一支不封油为开
20、管。同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养 1， 2， 3， 7天观察结果。 结果 观察： 只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型 。 （ 5） 吲哚的测定 培养基 ： 1%胰蛋白胨水溶液；调 pH=7.2 7.6，分装 1/3 1/4 试管， 115蒸气灭菌 30min。 接种 ： 把新鲜的待测菌种接种于上述培养基中 ，于适温培养。 试剂 ： 对二甲基氨基苯甲醛 8g，乙醇（ 95%） 760ml，浓盐酸 160ml。 测定 ： 培养 1， 2， 4， 7天的培养液，沿管壁缓缓加入 3 5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加
21、 4 5滴乙醚至培养液，摇匀，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加入吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。 （ 6） 异染粒的测定 染剂 ： 甲液 ， 甲苯胺蓝 0.15g，孔雀绿 0.20g，冰醋酸 1ml，乙醇（ 95%） 2ml，蒸 馏水 100ml；乙液，碘 2g， 碘化钾 3g，蒸馏水 300ml 操作 ： 用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干（切勿温度太高）固定 用甲液染 5min 倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染 1min 水洗，吸干 镜检（油镜） 结果观察 ：
22、 异染粒呈黑色，其他部分呈暗绿色或浅绿色。 注意：染色用的菌种要培养 18 24h 的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结果。且染色要用已知 异染粒 结果的菌种做对比。 （ 7） 氧化酶的测定 试剂 ： 盐酸二甲基对苯二胺 1%水溶液 操作 ： 在干 净的培养皿中放入一张滤纸，滴上盐酸二甲基对苯二胺 1%水溶液，10 仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环取 18 24h 的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上 。 结果观察 ： 在 10s 内涂抹的菌苔现红色者为阳性， 10 60s 现红色者为延迟反应， 60s 以上现红色者不计，按阴性处理。 （ 8） 反硝化 培养基：普通肉汁胨培养液 100ml
23、， KNO3 1g,调 pH 7.2 7.4，分装试管，每管培养基高度约 5cm， 121蒸气灭菌 30min。 接种：用肉汁胨斜面菌苔为菌种，用接种环接种后用凡士林油封管，同时要以封油的不含硝酸钾的培养基 做对照。 结果观察： 培养 1-7天，观察含有硝酸钾的培养基中有无生长和是否产生起泡，如产生起泡表示有反硝化作用产生氮气，是阳性反应；但如果不含硝酸钾的对照培养基也产生起泡则只能按可疑或阴性处理，不产生起泡则为阴性。 （ 9）产氨试验 培养基：蛋白胨 5g， 蒸馏水 1000ml，调节 pH 7.2, 分装试管， 121 C灭菌 15-20min。 试剂： 将 20g 碘化钾溶于 50ml
24、 水中，并在此溶液中加碘化汞小粒至 溶液饱和为止（约 32g）此后再加 460ml 水和 134g 氢氧化钾，将上清液贮于暗色瓶中备用。 接种： 以幼龄种 子接种，置适温培养 1, 3, 5 天。 结果观察： 取培养液少许，加入试剂数滴，出现黄褐色沉淀为阳性。 （ 10）运动性（半固体琼脂穿刺法） 培养基：半固体培养基 牛肉 浸 膏 3g，琼脂 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏 水 1000ml， pH=7.0 7.2， 分装试管， 121蒸气灭菌 20min。 接种：用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内，适温培养。 结果观察：细菌的运动性可用透射光目测，如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状， 则表示试验菌有运动性。对生长快的细菌应培养 1 天后观察，如第一天不能判定可在第 2 3天再观察。如 2 3天时仍不能判定是否有运动性，可延迟5 6 天再观察一次 。因为游动力弱的细菌，在半固体培养基中第 1 2 天中尚不能从穿刺线游开，故需多培养几天观察。如试验菌在半固体培养基中产气，气泡会将
