1、 1 一、 名词解释 1.菌种的扩大培养： 菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 扩大培养流程：斜面培养 一级种子培养 二级种子培养 发酵 2.生长因子： 广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸，嘌呤，嘧啶，维生素等。 3.临界氧浓度： 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。对产物而言，便是不影响产物合成所需的最低浓度。 呼吸临界氧值可用氧气含量变化和 通气量测定。也可用一种简便的方法，用响应时间最快（ 95%的响应在 3
2、0s 内）的溶氧电极测定，其要点是在过程中先加强通气搅拌，使溶氧上升到最高值，然后中止通气，继续搅拌，在罐顶部空间充氧。 4.诱变育种 （ P37） ：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 5.培养基 （ P99） ：广义上讲培养基是人工配制的提供微生物或动、植细胞的生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料，同时培养基也为微生物培 养提供除营养外的其它所必须的条件。 常 用培养基必须具备的基本条件： 1）都必须含有合成细胞所必需的原料； 2）满足一般生化反应的基本条件； 3）一定的 PH 条件等。 6.前体
3、（ P107） ：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 大多数前体如苯乙酸对微生物的生长有毒性，以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为了减少毒性和增加前提的利用率常采用少量多次的流加工艺。 为生物合成含有苄基基团的青霉素 G，在发酵中加入前体如苯乙 酸或苯乙酰胺，加入量不能大于 0.1%，采用多次加入方式 7.反复补料培养 （ P219） ：随着补料的进行 ,培养液体积不断增大 ,达到一定程度时 ,将部分培养液从反应器中放出 ,剩下部分继续进行补料分批培养 ,如
4、此反复进行 , 即所谓反复补料分批培养。 8.呼吸商 ： CO2 的释放率与 02 的摄取率之比。 呼吸商 （ respiratoryquotient 简称 RQ），指生物体在同一时间内，释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或 摩尔数之比 ，即指呼吸作用所释放的 CO2 和吸收的 O2的分子比。 2 9.临界稀释率 ： Dc= m SF/(Ks+S F)， DDc:细胞洗光， DDc:能够达到稳态 稀释率 (D)是 连续培养 装置运转中的一个主要参数 (DF/V) ，表示单位容积培养液 (V)中不断流入的新鲜培养液的速率 (F)，其单位为 h-1。在稳态运转时， D 等于该微生物的 比生长速率 (
5、) 。临界稀释率 (Dc)指相当于最高比生长速率 ( max)时的 D 值。若 D 值超出 Dc，则连续培养器中的菌体最终因过于稀释而消失，这一状态常称洗空 (washout)。 在连续培养中，操作的稀释率不是可以随意改变的，而是有一个限度，根据 增大稀释率会造成细胞浓度下降，如果细胞生长跟不上稀释的速度，反应器内的细胞浓度就会不断降低，直至细胞完全被冲走。因此在连续培养中存在一个临界稀释率，超过此临界稀释率是连续培养就无法进行 。临界稀释率取决于加料中的限制性机制浓度，即细胞在此培养基中 达到的最大比生长速率，因而临界稀释率 Dc= m SF/(Ks+S F)。 10.空气的相对湿度 ： 周
6、围的空气中有水蒸气，空气中的水蒸气分压与饱和蒸汽压之比称为空气的相对湿度。 相对湿度是表示湿空气饱和程度的一个量，它是湿空气里水蒸气分压与同温度下水的饱和蒸汽压之比（通常以百分数表示）： %100swpp 11.补料分批培养： 一种介于分批培养和连续培养之间的操作方式 ,在进行分批培养的时候 ,向反应器内加入培养基的一种或多 种成分 ,以达到延长生产期和控制培养过程的目的 。 补料分批发酵适用的范围 : （ 1）细胞的高密度培养 （ 2）分解代谢物阻遏培养过程 （ 3）营养缺陷性菌株的培养 （ 4）前体的补充 12.竞争性抑制 （ P193） ：若在反应体系中存在着与底物结构相类似的物质，该物
7、质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降，这种抑制为竞争性抑制，该物质为竞争性抑制剂。 与底物结构类似的物质，能与酶的活性部位结合，从而阻碍酶与底物的结合，造成酶反应速度下降，这种抑制作用称为竞争性抑制。 13.培养 基的分批灭菌 （ P122） ：将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程 ， 也称实罐灭菌 。 分批灭菌是中小型发酵罐常采用的一种培养基灭菌方法。 14.发酵 ：原本是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙酸等的分解代谢过程。现在从广义上看做是微生物把一些原料分在合适的发酵条件下经特定代谢转
8、变所需产物的过程。 微生 物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢转变成所需产物的过程 。 微生物发酵过程分为：分批、补料 -分批、半连续和连续发酵等几种方式。 3 15.Ks： Monon 方程的半饱和常数。相当于 = max/2 时的基质浓度 ,g/L,是菌体对基质对亲和力的一种度量 . 16.空气湿含量 ： 1kg 干空气中所含水蒸气的 kg 数 ，又称为空气绝对湿含量 。 公式： p.134 17.合适诱变剂量 ：既能增加变异的幅度有能促使变异向正变范围移动的剂量 18. 倒种 （ 147） ： 以适宜的发酵液倒出适量给另一发酵罐做种子。 增大接种量是提高菌浓的有效、快捷的方法，
9、但由于种子罐的体积已定，无法通过加大种子培养液的体积来增大接种量，因此选择通过倒种增大接种量 。 19.自然选育 ：在生产过程中 ,不经过人 工处理 ,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选的过程 。 自然突变：指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为 10-8 10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。 20.生物反应动力 ：以生物反应过程的物料平衡为基础 ,研究生物反应过程中细胞生长、底物消耗和产物生产率之间的关
10、系和特点。 21.VVM： 单位时间（ min）单位体积（ m3）培养基中通入标准状况下空气的体积（ m3），一般为 0.1-2.0。VVM 过大，通入空气过多，则容易出现空气的逃逸现象。 四简答题 1.以下三种酶反应抑制的双倒数图，根据分别判断各为什么性质的抑制，并说明抑制剂对 Kma 和Vma 有什么影响？ (说明： i , s ,v 分别表示抑制剂浓度、底物浓度、反应速度 ) (p.194) A 竞争性抑制： Vma 不变， Kma=Km(1+i/Ki) B 非竞争性抑制： Vma=Vm(1+i/Ki)， Km 不变 C 反竞争性抑制： Vma=Vm(1+i/Ki)， Kma=Km(1+
11、i/Ki) -1/Km 1/Kma i i i i=0 i=0 i=0 1/Vma 1/Vma 1/v 1/v 1/v 1/Vm 1/Vm 1/Vm -1/Km 1/Kma A B C 1/s 1/s 1/s 4 2.pH 是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数是代谢活动的综合指标。因此，必须掌握发酵过程中 pH 变化规律 .请你谈谈 pH 对发酵的影响。 答 ： pH 对发酵的影响 、 （ 1） pH 影响酶的活性。当 pH 值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻 （ 2） pH 值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影
12、响新陈代谢的进行 （ 3） pH 值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利 用 （ 4） pH 影响代谢方向 pH 不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23 时发酵产生柠檬酸，在 pH 近中性时，则产生草酸。 谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和 N-乙酰谷氨酰胺 注意： pH 在微生物培养的不同阶段有不同的影响 3.*大规模发酵一般都要进行种子的扩大培养，那么作为种子有那些要求 ？ 答： 种子必须具备的条件 : 菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长 生理性状稳定 菌体总
13、量和浓度能满足大容量发酵罐 的要求 无杂菌污染（不带杂菌） 生产能力稳定 种子的质量要求： 108-109个 /ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2 时结束， 6.8 8 7.0-7.2 活力旺盛 种子的质量要求 量：要求达到一定的浓度 质 : 形态 (生长处于某个阶段、均匀 等 )理化指标： C、 N、 P 的含量， pH 酶活等 4.*请你简单谈谈对于一个分批发酵的两个控制阶段研究的重点和目的。 P.117 答： 一个分批发酵过程从开始到结束经历着不同的阶段，对于大多数产品中试可以分成成长期和产物形成期两个阶段。生长阶段表示为微生物快速的 生长，并很快积累到较高的浓度，而
14、产物几乎不合成或仅有少量合成；接下来的一个阶段为产物形成阶段，产物形成阶段一般在整个生产过程中占据较多的时间，在这一阶段微生物的浓度仅有少量的变化，而产物浓度在快速积累。 对于分批发酵过程的优化控制应当分为两个阶段，而且各间断的控制重点应当有所侧重。 第一阶段是控制菌体的生长，目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态，即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成。这个阶段虽然占发酵过程的时间不多，但十分关键，因为微生物酶系的形成往往是不可逆的。 这 一阶段的研究必须从 产物 合成的代谢调控机制入手，具体分析每个产品制约着产物合成的主要代谢调控机制，来分析发酵开始的营养条件（包括供氧）和
15、环境条件（如温度、 pH 等），找出主要的影响因素对其进行控制。 5 第二阶段是控制产物的合成。 对于一个分批发酵过程研究的重点和控制的目的应当是：在菌体生长阶段找出影响产物分泌酶系的主要因素，并加以控制使菌体长好后处于最佳的产物合成阶段 ；在产物形成阶段找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。 5.*培养基分批灭菌和连续灭菌各自的优缺点是什么？ 答：分批灭菌：优点 ：无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌要求低。缺点：灭菌温度低，时间长而对培养基成分破坏大，其操作难于实现自动控制。 连续灭菌：优点：加热时间短，热利用率高，设备利用率高
16、；对培养基营养成分损害小。 连续灭菌：优点：加热时间短，热利用率高，设备利用率高；对培养基营养成分损害小。缺点：对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于 0.45MPa。同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。 6.*简要说明在发酵过程中引起 pH 变化的原因。 答： 1） 基质代谢 （ 1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成 小分子酸、醇，使 pH 下降。糖缺乏， pH 上升，是补料的标志之一（ 2）氮代谢：当氨基酸中的 -NH2 被利用后 pH 会下降；尿素被分解成 NH3， pH 上升， NH3 利用后 pH 下降，当碳源不足时氮源当碳源利用 pH 上升。（ 3）生理酸碱性物质利用后 pH
17、 会上升或下降 (4) 消泡油添加过多 2） 产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液 pH 变化。如有机酸类产生使 pH 下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使 pH 上升。 3） 菌体自溶， pH 上升，发酵后期， pH 上升。 7.简要回答溶氧在发酵过程中进行 时时监控的作用？ 答： 溶氧作为发酵异常的指示： 1） .操作故障或事故引起的现象可以从溶氧变化反映出来：例如搅拌出 现事故或加油过多。 2） .中间补料是否得当可可以从溶氧变化反映出来；例如赤霉素发酵过程出现“发酸”现象 ，过几小时溶氧上升。 3） .污染杂菌 4.污染了噬菌体 5.作为质量控制的指标；例如天冬氨酸
18、发酵。 这一系统优点； 1） .能够使发酵操纵更接近于最佳化 6 2） .达到 “ 控制 ” 参数所需时间短 3） .可减少由于种子质量不稳定而造成批与批之间的产品波动 4） .能及时纠正搅拌与通气参数以克服发酵过程中发生的干扰。 8.*请简述在重要工业微生物的分离中，要求获得高产菌株的同时，还需考虑那些重要指标利于推广到生产过程中？ p.33 答：（ 1）菌的营养特征。在发酵过程中，常会遇到要求采用价廉的培养基或是用来源丰富的原料，如用甲醇作为能源，一般用含有这种成分的分离培养基便可筛选出能适应这种养分的菌种。 （ 2）菌的生长温度应选择温度高于 40 的菌种。这样可以大大降低大规模发酵的冷
19、却成本。因此用这一温度来分离培养高温产生菌在经济上是有利的。 （ 3）菌对所采用的设备和 生产过程的适应性。 （ 4）菌的稳定性 （ 5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度。 （ 6）容易从培养液中回收产物。 9.连续灭菌的流程是什么？并简要说明各操作单元作用。 答：配料 预热 加热 保温 降温 （ 1）配料：在配料罐中进行配制 （ 2）预热：预热桶作用一是定容，二是预热。 预热的目的：减少震动和噪音；培养基在后续加热过程中能迅速升温；减少冷凝水带入培养基。7090 （ 3）加热：在连消塔中进行 （ 4）保温：维持罐 操作培养基在维持罐中停留时间加热 （ 5）降温：快速降温避 免培养基成分受到
20、破坏。采用设备喷淋冷却器、板式换热器、真空冷却器、螺旋板换热器等。 10.简述诱变育种工作中应注意的几个事项 7 答： （ 1）出发菌株的选择 出发菌株标准 :产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。 （ 2）复合诱变因素的使用 出发菌株通常有三种 :从自然界分离得到的野生型 ;通过生产选育的菌株即自发突变选育；已经通过诱变选育的菌株 .对于不同出发菌株考虑采用不同的诱变剂进行处理 （ 3）剂量的选择：变异率与致死率有一定的关系 ,利用致死率作为剂量选择的依据 . （ 4）变异菌株的筛选 （ 5）高产君主的获得需要筛选条 件的配合 11.请你绘制 出产物的比生产速率和比生长速率的关系图来表示产
21、物形成和菌体生长之间的三种关系。 答： P205 a.相关； b.部分相关； c.不相关 12.*请你设计一个测定菌体生长临界氧的测定方法，并绘制图从中指出临 界氧。 答： 溶氧电极法 停止供气 ： rdtdCL r=O 2O X 摄氧率 (r)：单位时间内单位体 积的发酵液所需要的氧量。 mmol O2 L -1h -1 。 呼吸临界氧值不一定和产物合成临界氧值浓度值相同。由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样 13.孢子培养基配置的基本要求是什么？ 答： 对孢子培养基的基本配制要求是： 第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖硝酸盐其它盐类的培养基
22、上都能很好地生长和产孢子，但若加入 0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。 第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。 第三，要注意孢子培养基的 pH 和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸 皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。大米培养基的水分需控制在 21% 50%，而曲房空气湿度需8 控制在 90% 100%。 15.补料分批发酵适用的范围 答：（ 1）细胞的高密度培养（ 2）分解代谢物阻遏培养过程 （ 3）
23、营养缺陷性菌株的培养（ 4）前体的补充 (5) 发生基质抑制过程 18.在发酵过程中温度对发酵有哪些影响？ 答： 温度是保证酶活性的重要条件 .一 般菌体生长和产物形成最适温度不同 .控制发酵过程中的温度对菌体生长和产物形成有这重要的作用 . (1)温度直接影响发酵过程中各种反应速率 .(2)通过改变发酵液的物理物理性质 ,间接影响菌的生物合成 .(3)温度会影响生物合成的方向 .（ 4）温度影响菌的调节机制 . 19.在好氧培养过程中是否溶解氧越高越好？ 答：培养过程中并不是维持溶氧越高越好，过高的溶氧对生长可能不利。这是因为氧的有害作用是通过形成新生 O,超氧化物基 O2-和过氧化物基 O
24、22-，或羟基自由基 OH-，破坏许多细胞组分体现的。 21.请简要谈谈在发酵过 程中污染杂菌的不良后果 答：染菌对工业发酵的危害，轻则影响产品的质和量，重则倒罐，颗粒无收，严重影响工厂的效益。 杂菌的危害 : 1.造成产率下降 ; 2.引起产物提取困难以及产物的收得率和质量下降 ; 3.杂菌可能分解产物 4.造成发酵环境变化 5.噬菌体引起菌体裂解 . 24.空气预处理有那些设备，各设备的作用是什么（以往复式空气压缩机为例）？ 答： 1.采风塔：空气的采集； 2.粗过滤器：又称前过滤器 作用：拦截一些较大的灰尘保护空气压缩机；阻拦一些微生物减轻总过滤器的压力。 3.空气压缩机 作用：提供动
25、力 4.空气贮罐 作用：消除压缩空气产生的脉冲。 5. 冷却器 作 用：当空气中含水量较高时，为了避免过滤介质受潮而失效，还可以达到降湿的目的。 6.气液分离设备 作用 :除去空气中的水和油 ,保护过滤介质 . 7.空气加热设备 9 作用 :降低空气的相对湿度 . 25. 利用不同限制性基质进行分批发酵，在不考虑抑制情况下培养时间和比生长速率及底物浓度关系见图，请用 Ks 解释为什么比生长速率下降的趋势不同？ 答： 在分批发酵过程中 ,如果只有一种限制性基质 ,则在任一时间的菌浓 . X t=X0+(S0-St) FS0 XT/Y =D D=F/(V0+Ft) 在稳态以前 ,由于 D 大于细胞的 所以基质的浓度增加 ,细胞以最高 增长 .随着时间推移 D减小 ,当减小到 =D 后 随 D减小而同步减小即 du/dt=dD/dt=d(F/V)/dt=-F2/V2=-F2/(V0+Ft)2 比生长速率的快慢取决于菌对限制性基质的亲和力的大小， Ks 小，对 的影响较小，当 St接近于 0 时， 急剧下降 ； Ks 大， 随 St 的减小缓慢下跌，当 St 接近于 0 时， 才迅速下降到零。 黄色为老师给的题目，绿色为下载的时本身的题目。绿色部分仅供欣赏。 u S1 u S2 比生长速率 u 基质浓度S基质浓度S比生长速率 u 图一 图二 时间 t 时间 t
