超声辅助处理对乳清分离蛋白糖基化产物的理化特性影响.DOC

1、 超声辅助处理对乳清分离蛋白糖基化产物的理化特性影响 王麒 李宛蓉 秦新光 刘刚 * （食品科学与工程学院 武汉轻工大学，武汉 430023） 摘 要 本实验 采用 超声辅助技术 对 乳清分离蛋白 (WPI)进行糖基化改性，并 与水浴加热法进行比较， 探究 两种处理方式对 糖基化反应 产物 理化性质 的 影响 。结果表明，与水浴法相比，超声 辅助法可以更快地促进糖基化反应的进行，且 对糖基化产物的理化性质有较大改善；当超声温度为 70 ，功率为 300 W，超声时间为 40 min 时， 乳清分离 蛋白 和葡萄糖的接枝度达到 48.10%， 且乳 清分离蛋白 葡萄糖接枝物 的 乳化性、在等电点

2、处溶解性均增大 。 乳化系数 由 23.67 m2/g 增大到 40.84 m2/g；等电点附近的溶解度由 19.09% 增大到 47.95% 。且以接枝物为基质的乳液的粒径更小，储藏稳定性更好。 关键词 超声辅助技术 理化特性 乳清蛋白 中图分类号： TS201.2 Effect of ultrasonic assisted treatment on physicochemical properties of whey protein isolate glycosylation Wang Qi Li Wanrong Qin Xinguang Liu Gang* (College of Foo

3、d Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, 430023) Abstract In this paper, whey protein isolate was glycosylated with glucose by ultrasonic assistant technology .Comparing with classical heating methods, the effect of two handle ways to physico-chemical properties of whey protei

4、n isolate glycosylated reaction products was investigated. The results show that the ultrasonic assistant could accelerate the process of glycosylation, and im-prove the physical and chemical properties of glycosylated products by comparing with the water bath method. The degree of graft reaction wa

5、s 48.10% under the Ultrasonic temperature 70 C , power 300 w, ultrasonic time 40 min. And emulsifying properties and solubility at isoelectric point of whey protein isolate-glucose graft both increases .The emulsion ability index increased from 23.67 m2/g to 40.84 m2/g, and the solubility in the vic

6、inity of isoelectric point increased from 19.09% to 47.95%. Moreover, the graft-based emulsion has a smaller particle size and better stor-age stability. Key words ultrasound assisted technology, physicochemical characteristic, whey protein isolate 基金项目：国家自然科学基金（ 31771925） 收稿日期： 2018-02-18 作者简介：王麒，男

7、， 1992年出生，硕士，食品科学 通 信 作者： 刘刚，男， 1982年出生，副教授，食品科学、蛋白质化学 乳清分离蛋白 （ whey protein isolate, WPI） 作为乳制品加工的副产物，占全乳蛋白的20%1。 来源广泛，价格低廉，且因其具有多种人体必须氨基酸及其他营养物质，而受到人们广泛认可，目前已广泛应用于食品领域。 但是乳清分离蛋白的某些性质也使其应用范围受限，如 其 热稳定性较其他蛋白都低 2， 容易发生 热 变性 。 这是由于乳清分离蛋白中三种主要成分： 乳清蛋白、 乳球蛋白以及牛血清蛋白的热变性温度均在 70C 左右 3，高温会造成蛋白的变性聚集。 而且这三种蛋白

8、的等电点均在 pH5.0 左右 4,5，因此 乳制品在酸性条件下容易发生蛋白聚集现象。 目前，如何提高乳清分离蛋白耐酸、耐热性已成为乳制品行业热点问题。 美拉德反应是糖分子与蛋白质分子上的氨基通过共价键结合形成糖基化蛋白的化学反应 6。 而糖 基化改性后 的蛋白热稳定性、乳化性等物化性质均明显提高。 目前，美拉德反应主要通过湿法和干法两种方式进行。而且 两 种 方法所得的美拉德反应产物性质均优于原蛋白。研究发现乳清蛋白 -葡聚糖糖基化产物的乳化性明显增强 7。杜研学等 8利用干法美拉德反应，对 从 米渣 中提取的 谷 蛋白进行糖基化改性，其所得的糖基化改性产物表面疏水性显著降低，功能性质在广泛

9、 pH值范围内显著提高。 超声技术在食品工业的应用十分广泛 9,10， 由于超声辅助 生产， 提高了生 产率 、 缩短 加工 时间 ， 操作简单节约成本等优点近年来受到从业者的青睐 11。而超声辅助技术也在美拉德反应中得到应用， Li 等 12研究了超声处理对花生分离蛋白 -葡甘露聚糖共聚物的物化性质影响，其结果表明超声处理 花生分离蛋白与葡甘露聚糖，促进了糖基化反应的进行，其糖基化产物的物化性质明显提高。 本试验 采用 超声辅助 与水浴加热两种方式促进 乳清蛋白糖 基化反应， 制备乳清分离蛋白与葡萄糖共聚物 ， 并 比较 两种处理方式 制备的糖基化 产物 在 游离氨基 以及 理化性质 等方面

10、的差异 ， 以此 探讨超声辅助羰基化反应的机理 。 1 材料与方法 1.1 材料 与试剂 一级 大豆油；乳清分离蛋白 (蛋白含量 96.88%)；葡萄糖（分析纯）； 其他试剂均为国药集团化学分析有限公司分析纯。 1.2 仪器 T-18 型高速分散仪 ；超声仪（探头为 6mm） FS-系列超声波处理器； Malvern200 型激光粒度分析仪； 高压 循环均质机； TU-1800 紫外可见分光光度计。 1.3 方 法 1.3.1 样品制备 称取 等量 的 乳清分离蛋白（ WPI）和葡萄糖（ glucose , G）溶于 0.2 mol/L pH=7.5 的磷酸盐缓冲溶液 中， 配制 成 浓度为

11、10 mg/mL 乳清分离蛋白、葡萄糖 混合溶液 ，搅拌 1h 并预热至一定温度。分别取几份混合溶液在最佳超声条件下（超声温度 70 ，超声功率 300 w，预实验测得）进行不同超声时间 (5、 10、 15、 20、 30、 40、 60min)处理 。 将所得溶液进行冷冻干燥，冻干后的粉末 4C 下保存。另取等量的混合溶液在水浴锅中进行 70 处理，加热时间分别 为 3、 6、 9、 12、 24、 28、 32h。后续处理步骤与超声处理组相同。 1.3.2 游离氨基 测 定 采用 邻 苯二甲醛（ OPA）法 13测定游离氨基含量从而计算 WPI 接枝度。 取 40 mg OPA溶于 1

12、mL甲醇中，加入 0.1 mol/L 25 mL硼砂溶液、体积分数为 20% 2.5 mL十二烷基磺酸钠溶液、 100 L -巯基乙醇， 并 用去离子水定容至 50 mL， 即得 OPA试剂。 准确称取超声、水浴处理时间分别为 0、 20、 40、 60 min 的蛋白样品 ，将其 配制成 0.5 mg/mL的溶液，取 样品 溶液 400 L，加入 8mLOPA试剂，混合均匀后置于 35 水浴 2 min，取反应后的溶液在340 nm 下测定吸光 值 。 并以 赖 氨酸作标准曲线，计算样品中游离氨基的含量，并计算接枝度， 接枝度 (DG)的计算公式： DG =（ A0-At) /A0100 %

13、 式中： A0 为 未进行糖基化反应 WPI 的 游离氨基含量 At 为 糖基化反应后 WPI-G 接枝 物的 游离氨基含量 1.3.3 溶解性测定 分别准确称取一定量的 WPI、超声处理 40 min、水浴 28 h 处理的样品 ，配制成 浓度为1 mg/mL的溶液 ， 将溶液等体积分 为 6 份 ， 用 1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH溶液 将 6 份溶液的 pH值依次调节为 3、 4、 5、 6、 7、 8，室温下磁力搅拌 10 min (搅拌过程中 保 持 pH值稳定 ) 后，在 4 C 下离心 15 min (10000 r/min)，取上清液 用酶标仪测定 溶液在

14、 590 nm 处的吸光度， 以 5 mg/ml BSA溶液作 标准曲线，计算样品中蛋白浓度 。蛋白质的溶解性表示为上清液蛋白浓度占相应的总蛋白浓度的百分比 (A590/ A 总 100%)。 1.3.4 乳化性测定 参考 Meng等 14的方法，并略有改动， 分别取 超声处理 40 min、水浴 28 h处理后的 WPI-G共聚物样品 ， 用 pH为 7.0 的磷酸盐缓冲液 配制成 质量分数为 0.5%的溶液 ，取 3ml的蛋白溶液和 1 mL大豆油 采用高 速 均质机在 20000 r/min 室温下 均质 1 分钟， 从 试管底部 取 50 L匀浆液 ， 用质量分数为 0.1%的 SDS

15、 溶液稀释 100 倍并用涡旋仪混合 均匀 ， 以 SDS 溶液为空白，用紫外分光光度计 分别 测定 500 nm 处的吸光值 。 放置 10min 后 同样位置测定吸光值。乳化性 系数 EAI 和乳化稳定性 系数 ESI 由下式计算： EAI（ m2/g） =（ 2.3032nA0） /（ C10000） ESI=A0t/(A0-A10 ) 式中： n 为 稀释倍数； 为 油相体积分数 0.25； C为 蛋白质的浓度 ， g/ml； A0为 均质后样品 500 nm 吸光 度； A10为 均质 10 min 后的样品在 500 nm 处的吸光度； t为 10 min 1.3.7 乳液制备 及

16、粒径分析 分别称取 WPI 以及超声处理 40min、水浴 28h 处理后的 WPI-G 共聚物分别溶于 pH为7.5 的 磷酸盐缓冲体系中 ， 配制成 2%（ w/v） 的溶液 ， 搅拌使其完全溶解， 加入 0.02%的叠氮钠 ， 抑制微生物的生长 ， 以样品溶液 为水相 。以 油水比为 1:9 的比例加入大豆油 ， 置于 高速 均质 机中 以 20000 r/min 转速进行高速分散 ， 制备粗乳 ， 再 将粗乳 液 通过 高压 均 质机均质（均质温度 4 C ，均质压力 30 MPa）得到 乳液，并将乳液置于 4 冰箱保存。各取三种乳液 10 L，用蒸馏水稀释 100 倍，置于 Malv

17、ern 200 型激光粒度分析仪中分析粒径大小 ， 20天后 ， 另 取乳液 10L ，蒸馏水稀释 100 倍 ， 再次测量乳液粒径大小变化 。 2 结果与分析 2.1 游离氨基含量 分析 通过测定 两种 处 理 方式下 蛋白溶液中的 游离氨基含量， 其结果如 表 1 所示 ， 水浴加热处理 WPI的游离氨基含量无明显变化， 当 WPI以超声波法进行加热时，游离氨基的浓度从 0.066 mg/mL增至 0.076 mg/mL。 表明 超声处理有助于 WPI 与 葡萄糖 聚合反应 时 释放出更多的游离氨基。 这与 Mu15等的结论相吻合， 超声处理 过程中产生的 泡沫空化 效应 增加了坍塌气泡周

18、围区域的局部温度和压 力 ， 导致蛋白质伸展 、 水解，肽键被破坏 ， 大量 的氨基酸残基暴露出来。 表 1 不同 处理 方式下 WPI 游离氨基含量 处理时间 /min） 游离氨基含量 / mg/mL 水浴 处理 超声处理 0 0.066 0.066 0.001 20 0.066 0.069 0.001 40 0.066 0.073 0.001 60 0.067 0.076 0.001 注：其他标准偏差均 0.001。 2.2 接枝度分析 接枝度可由游离氨基含量计算 ， 因此 两种 处理方式下 WPI 和葡萄糖的接枝度 结果 如表2 所示 ， 同一接枝度下的超声辅助处理下的糖基化反应时间明

19、显低于水浴加热时间， 超声 辅助 法 处理 WPI 与葡萄糖 接枝度 达到 44.61%只需 30 min，而 相比之下， 通过传统加热法 接枝度 达到 45.05%则需 24 h。此外，无论是水浴加热还是超声波处理，共聚物的接枝度均呈现出先增大后减小的趋势。 这与 JIANG 等 16的 研究 相 符 ， 可能是由于在 美拉德 反应初始阶段，乳清分离蛋白结构部分展开，乳清分离蛋白与葡萄糖受热后逐步结合，接枝度逐渐提高；但过度加热时，一方面使乳清分离蛋白中的部分赖氨酸被破坏，另一方面则造成乳清分离蛋白结构的 充分 伸展，乳清分离蛋白 分子 之间的相互作用 增强 ，导致 蛋白凝聚、 沉淀，不利于

20、接枝反应的进行，最终导致接枝度反而降低。 因此 本文选取 超声 处理 40min、 水浴处理 28 h作为 后续试验的样品 处理 条件 ，此时两种 处理 条件 得到的 共聚物 接枝度均为 48%左右，表明 美拉德反应程度较为接近， 作为 后续实验的 样品 处理 条件 具有可比较性 ， 以便 进一步比较超声 与水浴 两种 处理方式 对反应产物物化 性质的影响更为明显。 表 2：水浴和超声处理 下 WPI 和 葡萄糖 的接枝度 超声处理 水浴加热 时间 / min DG/ % 时间 / h DG/ % 5 10.54 0.86 3 21.36 1.85 10 19.73 1.61 6 29.37

21、2.40 15 31.53 2.04 9 34.37 1.24 20 38.63 1.43 12 39.75 2.12 30 44.61 1.56 24 45.05 1.35 40 48.10 1.28 28 48.57 0.94 60 46.61 0.86 32 47.28 1.52 2.3溶解性分析 蛋白的溶解性与其他物化性质具有相关性， 因此我们对不同 pH值下的 WPI 及两种处理 方式的 WPI-G 共聚物进行溶解性分析，结果如图 1 所示， 未经处理的 WPI 在 pH在 5.0左右溶解度最低，这是由于 WPI 的 pH在等电点（ 5.0）左右，此时蛋白净电荷为零，由于电荷不对称而

22、产生静电相互作用引起蛋白发生聚集。 而 改性后的 WPI 糖基化产物在 pH 5.0处溶解度明显提高，且 超声处理相比于水浴热处理条件下的 WPI-G 共聚物溶解度更好。 可能是由于超声处理导致肽键断裂，蛋白亲水性氨基暴露提高了蛋白质的溶解性。 3 4 5 6 7 8102030405060708090100溶解度(%)pHW PI水浴超声波图 1. 不同处理方式下 WPI-G共聚物的溶解度 2.4 乳化性分析 WPI 和 WPI-G 共聚物的乳化性和乳化稳定性变化如图 2 所示 ， 0 表示 WPI-G 共聚物水浴加热 28 h， 随着 超声处理时间的延长 ， WPI-G 共聚物的乳化性逐渐

23、增强， EAI 值在超声时间为 40 min 时达到峰值。而水浴加热 WPI-G 糖基化产物的 EAI 值也明显高于原 WPI。超声处理 40 min 的 WPI-G 糖基化产物 EAI 值由初始值 20.67 m2/g 增加至 40.84 m2/g，增加了99%。与水浴处理的 WPI 糖基化产物相比 EAI 值增加了 59%。这均表明，超声辅助糖基化反应有效地改善了乳清蛋白的乳化活性和乳化稳定性。而 且，超声辅助糖基化反应产物的乳化稳定性指数随超声时间的延长而逐渐增加，在超声时间为 30 min 时达到峰值 76.85 min，而后逐渐降低，可能是由于超声时间过长， 溶液温度升高 ， 蛋白分

24、子 结构 被破坏 ，出现絮凝等现象，导致后期乳化稳定性降低。 W PI 0 5 m i n 1 0 m i n 2 0 m i n 3 0 m i n 4 0 m i n 6 0 m i n -01020304050607080EAI ( m2/ g )ESI ( m i n )EAI( m2/g)样品01020304050607080ESI( min)图 2. WPI 及 WPI-G共聚物不同超声处理时间下的 EAI 和 ESI 值 2.4粒径分布 两种 处理方式下 制得的 WPI 共聚物乳液粒径分布如图 3 所示，结果表明 两种糖基化产物为基质的乳液平均粒径均明显小于原 WPI 乳液，且超

25、 声处理所得的糖基化产物乳液粒径更小， 平均粒径为 60 nm 左右，水浴处理的 WPI-G 共聚物乳液平均粒径为 200 nm 左右，原WPI 乳液平均粒径为 300 nm 左右 。而且 三种乳液 于 4 冰箱中静置 20 天后，所测得的乳液 平均 粒径均没有明显变化，超声处理制得的 WPI-G 共聚物乳液平均粒径仍小于 100 nm。表明 WPI 及 WPI-G 共聚物乳液均具有良好的储藏稳定性。这可能是由于 WPI 及其共聚物作为乳化剂提高了乳液稳定性 17， 且超声处理的 WPI-G 共聚物乳化性高于水浴处理的WPI-G 共聚物，可能是由于超声处理能量更加集 中，使 WPI 与葡萄 糖

26、的接枝 反应进行的更加完全 ， 从而使其处理后的共聚物乳化性能更好 。 图 3. 不同处理 方式 下 WPI 和 WPI-G共聚物乳液的 的粒径分布 3 结论 超声辅助 和水浴加热均 有利于乳清分离蛋白与葡萄糖 糖基化 反应 的进 ， 而 超声 辅助法 相对于水热法效果更佳明显 ， 具体结论如下 （ 1） 乳清分离 蛋白 和葡萄糖的最佳超声 处理温度为 70 ，功率为 300 W，当超声时间为 40 min 时， 蛋白 溶液中游离氨基浓度增加 ， 且此时 接枝度最佳为 48.10%， 美拉德反应程度达到最佳 ， 而水浴加热处理达到相同的接枝度需耗时 28 h。 （ 2） 超声辅助 处理 和水浴

27、加热处理的 WPI-G 共聚物在 等电点附近的溶解性 均 明显增强，溶解度由 19.09% 增大 至 47.95% 。 在等 pH条件下超声处理的 WPI-G 共聚物的溶解性优于水浴加热处理 。 （ 3） 超声辅助处理 WPI- G 共聚物的 乳化性增强， 其 乳化性 数 由 20.67 m2/g 增至 40.84 m2/g，增大了 99%， 而相对于水浴加热法 乳化系数 25.3 m2/g 增大 了 59%。 （ 4） 超声辅助处理 所得的 WPI-G 共聚物乳液 平均粒径为 60 nm， 明显小于 水浴加热 处理 的 WPI-G 乳液粒径 （ 200 nm） ， 二者 与 未 处理的 WP

28、I 乳液 （粒径 300 nm） 相比，粒径更小、 更稳定，储藏稳定性更好。 参考文献 1 P X Qi, C I Onwulata. Physical properties, molecular structures, and protein quality of tex-turized whey protein isolate: Effect of extrusion moisture content J. Journal of Diary Ca-seinience, 2011, 94(5): 2231-2244 2 杨赫鸿 , 刘骞 , 孔保华 , 等 . 美拉德反应乳清分离蛋白特性的变

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