1、罗氏诊断二代测序技术在HBV耐药检测中的应用,罗氏诊断 应用科学市场部 刘璐璐,HBV 耐药性产生,病毒每天高速复制，并在复制时发生错误，这些自发突变导致突变株出现。突变株增殖能力通常低于野生型，因而在未用药的群体中占少数。但在病毒药物作用下，药物对于耐药性的突变有选择作用，导致了耐药菌株成为优势株，导致药物治疗的失败。,,耐药是核苷酸类药物的共性耐药检测的意义治疗前检测，有助于临床判断用药是否有效；治疗中每 36个月检测，有助于观察疗效，及时调整用药,EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. Eu
2、ropean Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.,用药后出现耐药,拉米夫定 阿德福韦酯 恩替卡韦 替比夫定 替诺福韦,测序用于病毒耐药检测深度测序可检出低频准种,提早判断准种组成，在劣势菌种未发展成为优势菌种之前，即调整用药策略；降低治疗失败可能性，减少对身体伤害。,454高深度测序优势,已经成功实现对于RT基因区段1%突变位点的发现，比目前常用的一代测序及线性探针反向杂交法更加灵敏进行相对定量，对于病毒群体中突变数量改变进行跟踪深度测序的运用将较传统方法提前3-6个月检测出突变，因此能够更
3、好的抓住治疗的时机并给出治疗的方案,454测序系统发展测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备,GS 20,GS FLX Standard,2005,2007,2008,Future,Even Longer Reads,Higher Density,Later,GS FLX Titanium,GS Junior Titanium,GS FLX+,2011,独立实验室适用型精巧型 二代测序平台 GS Junior,GS Junior 测序步骤概览,Mix ssDNA & capture beads,454 测序流程 文库构建,1. 454文库构建：Shotgun Paired-end300bp1
4、Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb*PCR产物可直接测序,传统文库构建：BAC克隆-Shotgun/PCR,一个片段 = 一个反应珠,454 测序流程 emPCR,2. emPCR每个DNA分子独立进行PCR反应后独立测序扩增效果好，适应高GC含量片段、甚至FFPE样本,一个反应珠 = 一个读长,单克隆测序的价值通过 emPCR实现单克隆,直接阅读每一种分子结果突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息每个DNA分子独立进行PCR反应后独立测序扩增效果好，适应高 GC含量片段、甚至FFPE样本,Sanger 流程-混合测序,454 流程-单克隆测序,454测序流程 测序,特异的测序引物和单链D
5、NA模板结合, 加入一种dNTP DNA 聚合酶的作用下，单个 dNTP与模板的下一个碱基配对，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi) 在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS结合形成ATP在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，被CCD捕捉 Apyrase降解剩余的dNTP和残留的少量ATP加入另一种dNTP重复2-5步骤在每一个测序循环里，碱基以同样的次序(TACG)流过PicoTiterPlate板当模板链的互补核苷酸加入延伸链时，会产生了荧光信号荧光信号强度与所加入的核苷酸数目成比例荧光信号被CCD照相机记录,荧光素酶,ATP 硫酸化酶,氧化荧光
6、素,可见光,3. 基于焦磷酸反应的边合成边测序,13,Sequencing By Synthesis,A A T C G G C A T G C T A A A A G T C A,C,T,A,Repeated dNTP flow sequence:,G,G,T,C,A,G,T,C,A,G,T,T,T,T,C,A,G,G,A,T,C,C,C,G,A,T,T,G,C,T,A,Anneal Primer,Process continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.,边合成边测序,实验体系的不
7、断优化使得当前可获得Junior 平均为400bp的读长并将继续以提升读长为技术的发展方向之一,454测序流程 数据获取,图像处理,信号处理,454测序流程数据分析,测序与分析同时进行，10小时完成10小时产出 10万条以上的序列自带4套软件，满足多数应用需求软件自动过滤，高质量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的准确性,GS Junior在德国大肠杆菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms, Nature Biotechnol
8、ogy, 2012 DOI: 10.1038/nbt.2198454 GS Junior拥有最长的读长，平均读长在522个碱基，99%的序列可以用于基因组拼接6月3日收到样本，6月5日完成全部测序与机制确认工作数据分析仅由HPA的非专业生信团队，不到半天时间即得到结果,,序列读长分布图,Junior 测序系统运行产生的读长范围为50-600bp，甚至更长 shot gun实验将利用几乎全部数据平均读长为400bp典型读长在 450-550bp范围 Amplion 实验将主要根据典型读长进行PCR引物设计,CGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
9、GAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCT,Complex,Short read technology,454 长测序能够带来什么emPCR 保证样本的获得，长焦磷酸确保阅读,长读长的价值,一条reads通读一个目标序列，无需拼接，避免错误产生与时间消耗通过一条reads判断突变的连锁关系更少引物获得更多目标引物设计的区间更灵活Junior1条reads 既可通读HBV耐药相关基因的PCR产物,The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85.,PCR扩增子文库的设计长读长给予更多引物设计空间，1条reads
10、通读热点突变区域,454 B-primer (19 bp),Locus specific PCR amplification,emPCR & 双向测序,Target specific sequence (ca. 25 bp),454 A-primer (19 bp),Sequence of interest,200 400 bp,通过MID序列，可以混合多个样本测序同时测序,Data analysis,RT基因可设计3个PCR产物片段S基因可设计2个PCR产物片段C基因可设计1个PCR产物片段X基因可设计1个PCR产物片段Pre-C基因可设计1个PCR产物片段,454测序在HBV 耐药基因测序
11、的应用方案,454 测序步骤HBV耐药检测应用,emPCR(乳滴PCR)扩增每一带有MID与测序引物的HBV耐药突变高发DNA片段在其各自的微乳滴中进行独立扩增，排除了其它竞争性或污染性序列对 PCR反应的影响。焦磷酸测序将所有结合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中进行测序。PTP板的孔径恰好仅能容纳一颗磁珠。将PTP板置于GS测序仪中，单个核苷酸依次流经孔洞和DNA捕获磁珠间。当所加入的核苷酸与模板互补时，便产生化学发光信号，进而被GS系统的CCD相机记录。,454的分析结果呈现可检测单点突变,454的分析结果呈现可关注已知突变,Multiple Mutatio
12、ns in a Codon Associated with NRTI Resistance,T69,Confidential,Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI Resistance,Thr69 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% Serine,Confidential,454的分析结果呈现可检测有意义的连锁突变位点,已有RT基因突变数据库Standford HBVSeq,,Standford HBVSeq结果展示,,近两年使用454 发表HBV耐药检测文献,Analysis of hep
13、atitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. Ko SY, Oh HB, Park CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant amino Acid changes in the hepatitis B virus genome
14、. Rodriguez-Fras F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domingo E, Cubero M, Cams S, Ferrer-Costa C, Snchez A, Jard R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic he
15、patitis B virus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard G, Vazquez M, Benetti S, Fay F, Tanno H, Quarleri J. (2012) Antiviral Research ePub:Ultra-deep pyrosequencing analysis of the hepatitis B virus preCore region and main cata
16、lytic motif of the viral polymerase in the same viral genome. Homs M, Buti M, Quer J, Jard R, Schaper M, Tabernero D, Ortega I, Sanchez A, Esteban R, Rodriguez-Frias F. (2011) Nucleic Acids Research ePub:,GS Junior测序系统您身边的二代测序平台,经典可靠：运用454测序技术，与GS FLX测序系统相同的化学原理，平均读长达400bp （454已发文献超过2300篇）经济实用：仪器，计算机及实验配套设备起步成本低简单易用：包括完备的生物信息学分析软件，在普通计算机系统即可进行分析,Thank you !,We Innovate Healthcare,
